脊髓背角HCN通道在神經病理性疼痛中的作用及機制研究.pdf

1、外周神經損傷后造成的神經病理性疼痛是臨床上多見而難以治療的慢性疾痛，對人們的身體健康造成嚴重影響。因此，揭示其發(fā)生機制、進一步研發(fā)效果良好而副作用小的鎮(zhèn)痛藥物是疼痛研究領域的熱點。以往研究表明，外周神經損傷引起的背根神經節(jié)和脊髓背角神經元興奮性增高是產生神經病理性疼痛的關鍵。脊髓背角是痛覺傳導過程中重要的整合中樞，新近研究發(fā)現，分布于脊髓背角的超極化激活環(huán)核苷酸門控( hyperpolarization-activated cyclic

2、 nucleotide gated, HCN)通道在病理性疼痛的調節(jié)起重要作用，但其機制不清楚。此外，嘌呤能 P2X受體與疼痛密切相關，研究表明表達于脊髓背角神經元的P2X受體的激活促進了病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展。HCN通道與P2X受體均表達于脊髓背角神經元，那么，HCN通道是否通過影響背角神經元P2X受體的功能，進一步調節(jié)神經元的興奮性及傷害性信息的傳遞，目前尚不清楚。本課題通過制作大鼠坐骨神經痛模型，結合在體和離體研究，綜合應用行為學

3、、分子生物學等方法，從以下幾個方面進行觀察：1） HCN通道在坐骨神經縮窄性損傷（chronic constriction injury，CCI）所引起的神經痛中的作用；2）HCN通道是否調節(jié)CCI大鼠脊髓背角神經元P2X受體的表達；3）HCN通道對培養(yǎng)的脊髓背角神經元P2X受體功能的影響。本課題從不同角度探討HCN通道在神經病理性疼痛中的作用及相關機制，為開發(fā)以HCN通道為靶點的新型鎮(zhèn)痛藥提供理論基礎。
　　目的：
　　1

4、.觀察脊髓背角神經元HCN通道在神經病理性疼痛中的作用；
　　2.觀察HCN通道對培養(yǎng)的脊髓背角神經元P2X受體功能的調節(jié)作用及機制。
　　方法：
　　1.在體實驗：7～8周齡成年SD大鼠（雄性）48只隨機分為6組：(1)sham組(假手術組)、(2)CCI組(鞘內注射生理鹽水)、(3)~(6) CCI+ZD7288(鞘內分別注射1,10,30,50μg ZD7288)，每組8只。CCI及CCI+ZD7288組大鼠在鞘

5、內置管恢復5d后給予CCI術，術后鞘內給藥（2次/日，持續(xù)14d）；sham組大鼠不進行鞘內置管，僅游離坐骨神經，不結扎。行為學檢測：熱痛閾測定；免疫印跡技術檢測：脊髓背角HCN1,3,4通道、P2X2,6受體、P-PKA蛋白表達水平；
　　2.離體實驗：培養(yǎng)出生三天以內的SD乳鼠脊髓背角神經元，分為7組：①對照組；②ATP組（100μmol/L）；③無鈣液+ATP組，無鈣液預先孵育20min，再加入ATP；④TNP-ATP（10

6、μmol/L）+ATP組， TNP-ATP預先孵育10min，再加入ATP；⑤ZD7288（1,10,100,1000umol/L）+ATP組，不同濃度ZD7288先孵育10min，再加ATP；⑥8-Br-cAMP（100μmol/L）+ATP組；⑦ZD7288（100μmol/L）+8-Br-cAMP（100μmol/L）+ATP組，先加ZD7288孵育10min，再加cAMP孵育10min，最后加ATP。運用激光共聚焦顯微鏡技術觀察

7、神經元[Ca2+]i的動態(tài)變化。
　　結果：
　　1.大鼠CCI術后即第1d即形成穩(wěn)定的熱痛敏，至第14d熱痛敏仍持續(xù)存在，TWL明顯縮短（P＜0.05）；鞘內給予30μg HCN通道阻滯劑ZD7288可明顯延長CCI大鼠的TWL（P＜0.05）。Western Blot結果顯示，CCI組大鼠在術后7、14 d術側脊髓背角HCN1,3,4、P2X2,6及P-PKA表達顯著增加（P＜0.05）；鞘內給予ZD7288可顯著降低C

8、CI大鼠HCN1,3,4,P2X2,6及P-PKA的表達（P＜0.05）。
　　2.ATP（100μmol/L）可導致脊髓背角神經元[Ca2+]i升高，是由 P2X受體介導的細胞外Ca2+內流所致（P＜0.05）；HCN通道拮抗劑ZD7288（10-1000μmol/L，預孵育10min）可抑制ATP（100μmol/L）引起的脊髓背角神經元[Ca2+]i增高，且呈現劑量依賴性；8-Br-cAMP（cAMP類似物,100μmol/

9、L）可增強ATP引起的脊髓背角神經元[Ca2+]i升高，ZD7288（預孵育10min）可顯著抑制8-Br-cAMP的效應（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.脊髓背角HCN通道的激活可促進CCI所致的神經病理性疼痛的發(fā)生與維持；同時，神經痛時脊髓背角HCN通道的激活可促進嘌呤能P2X受體的表達。
　　2.HCN通道拮抗劑ZD7288顯著抑制脊髓背角神經元P2X受體誘發(fā)的[Ca2+]i升高，說明脊髓背角神經元HCN通