基于VP2和VP4 DHAV-3間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、eu茹一’IIllIll。[1llllllL[1lllllllLlllllllllllLlllllllllll訃麓號昱墅—旦(⑧呈篡【。R襞ICULTU掌RALU天NIVERS譬ITY碩士學(xué)位論文基于VP2和VP4DHAV3間接ELISA指導(dǎo)教師專業(yè)名稱研究方向檢測方法的建立何玲2017年5月～一一一中文摘要鴨甲型肝炎病毒(DuckhepatitisAvirusDHAV)是一種無囊膜包裹的單股正鏈RNA病毒，其基因組僅一個開放閱讀框(O

2、penreadng力ameORF)，共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和9種非結(jié)構(gòu)蛋白，主要有3個基因型(DHAV1、DHAV2、DH舾L3)，其中DHAV2主要在臺灣等地區(qū)流行，我國大陸地區(qū)未見報道，而DHAV1和DHAV3在我國普遍流行，且存在混合感染的情況，為該病的診斷治療增加了難度，為建立簡便、快速、應(yīng)用范圍廣的DHAⅣ3抗飼啪艦4方法，本研究主要針對DHAV3VP2和VP4基因進(jìn)行原核表達(dá)，并基于VP2和VP4融合蛋白建立了DHAV3間接EL

3、ISA檢測方法，所獲得的主要結(jié)果如下：1DHAV3VP2和VP4基因的原核表達(dá)、優(yōu)化、純化。本試驗(yàn)以DHAV3尿囊液中抽提的RNA為模板，通過RTPCR技術(shù)得到與預(yù)期結(jié)果一致的VP2和VP4目的基因片段，分別克隆至pET30a()、pET32a()原核表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化至宿主表達(dá)菌BL21(DE3)，經(jīng)過溫度、IFrG濃度優(yōu)化，SDSPAGE結(jié)果分析表明，融合蛋白VP2主要以包涵體的形式表達(dá)，在37。C，08mmoFLIPTG條件下誘導(dǎo)

4、表達(dá)量最大，經(jīng)切膠純化可得到較高純度的融合蛋白VP2：融合蛋白VP4主要以可溶性表達(dá)的形式存在，在37℃，0Ammol／LIPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)量最大，經(jīng)卜驢柱親和層析的方法可得到較高純度的融合蛋白VP4。Westemblot分析結(jié)果表明融合蛋白VP2和VP4能特異性結(jié)合兔抗DHAV3血清，說明它們具有良好的反應(yīng)原性。2基于純化的VP2和VP4蛋白建立間接ELISA檢測方法分別以純化后的重組蛋白VP2和VP4為包被抗原，經(jīng)過抗原包被濃度

5、、酶標(biāo)二抗稀釋度、包被條件、封閉條件、血清孵育時間、酶標(biāo)二抗時間、顯色時間等進(jìn)行一系列優(yōu)化，分別建立基于VP2和VP4蛋白的DHAV3間接ELISA檢測方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，基于VP2蛋白的ELISA檢測方法最佳包被濃度為223m，37。C孵育1h后4。C包被過夜，1％脫脂牛奶封閉1h，血清1：160稀釋后孵育1h，HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgG1：2000稀釋后孵育05h，單組份TMOII顯色10rain為最佳反應(yīng)條件，并確定陽性閾值為025

6、；基于VP4蛋白的ELISA檢測方法最佳包被濃度為26m／mL，37。C孵育1h后4。C包被過夜，5％脫脂牛奶封閉1h，血清1：20稀釋后孵育05h，HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgG1：1600稀釋后孵育lh，單組份TMB顯色液顯色10min為最佳反應(yīng)條件，并確定陽性閱值為029。本試驗(yàn)所建立的兩種間接ELISA檢測方法特異性好、重復(fù)性強(qiáng)、靈敏度高，與細(xì)胞中和試驗(yàn)結(jié)果總符合率可達(dá)9晰口80％，可用于DHAV3抗體的檢測。關(guān)鍵詞：DHAV3；VP