楸樹內(nèi)生真菌FSN002原生質(zhì)體制備與再生及其抗癌成分分離工藝研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生多種多樣的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，是尋找新型抗腫瘤藥物的新途徑。楸樹內(nèi)生真菌 FSN002是從胡桃楸樹皮組織內(nèi)部分離出來的木霉屬真菌，其發(fā)酵液具有很強(qiáng)的抗腫瘤的作用。本論文通過楸樹內(nèi)生真菌 FSN002原生質(zhì)體的制備和再生及其抗腫瘤活性成分楸靈素的分離兩個(gè)方面分別進(jìn)行研究。
　　楸樹內(nèi)生真菌 FSN002原生質(zhì)體制備與再生的合適條件為：菌絲培養(yǎng)18小時(shí)，采用0.8 mol/L KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，濃度為

2、20 mg/mL的Glucanex酶液，在28℃，100 rpm轉(zhuǎn)速振蕩酶解6小時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)到6×107個(gè)/毫克菌絲。通過熒光素二醋酸酯（FDA）染色表明所制備的原生質(zhì)體活力率可達(dá)到83％。原生質(zhì)體的釋放有頂端和中部斷裂兩種，以產(chǎn)生突出的方式再生。采用加入0.004%的去氧膽酸鈉的PDA固體雙層再生培養(yǎng)基再生，再生率可達(dá)到1.2%。楸樹內(nèi)生真菌FSN002的原生質(zhì)體制備和再生體系的建立為通過代謝工程進(jìn)一步改良菌種，提高內(nèi)生真菌的

3、抗癌能力奠定基礎(chǔ)。
　　其次我們以楸樹內(nèi)生真菌 FSN002發(fā)酵液中的黃色抗癌物質(zhì)楸靈素為目標(biāo)，研究了不同酸堿度條件下液相萃取和樹脂吸附兩種方法濃縮分離楸靈素的初步工藝。
　　研究發(fā)現(xiàn)楸靈素在酸性條件下不穩(wěn)定，在中性或者堿性條件下相對(duì)比較穩(wěn)定。楸靈素具有中等極性，在水中溶解度較大，不溶于石油醚、正己烷、苯等非極性溶劑。楸靈素具有酸性，在水中和堿反應(yīng)可生成鹽，并進(jìn)一步電離形成酸根陰離子，因此在水環(huán)境中楸靈素存在分子和酸根離子兩

4、種狀態(tài)，水溶液的酸堿性決定了這兩種狀態(tài)的分布平衡：酸性條件下多以分子形式存在，而在堿性條件下多以酸根離子形式存在。
　　在進(jìn)行乙酸乙酯的雙液相萃取中，當(dāng)在酸性條件下，楸靈素主要分布在乙酸乙酯相中，親水性雜質(zhì)留在水相中；當(dāng)繼續(xù)將水相酸堿度調(diào)節(jié)到堿性后，楸靈素又從乙酸乙酯相轉(zhuǎn)移回水相，疏水性雜質(zhì)留在乙酸乙酯相中得以分離。通過不同酸堿度下乙酸乙酯的萃取和反萃可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中楸靈素的分離。
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸性條件下楸靈素以分子狀態(tài)存在

5、，具有較高疏水性，可以高效吸附到HPD400、HPD450A、HPD200L、AB-8、HD20等反相樹脂上，也可以通過氫鍵作用吸附到聚酰胺樹脂上。在堿性條件下楸靈素以帶負(fù)電的酸根離子形式存在，可以高效吸附到 D380等陰離子交換樹脂，而在D72、D151等陽離子交換樹脂上則吸附微弱，僅存在由于樹脂基質(zhì)的疏水性導(dǎo)致的反相吸附作用。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以采用親水基質(zhì)的陰離子交換樹脂來進(jìn)行楸靈素分離。樹脂吸附和初步動(dòng)態(tài)層析實(shí)驗(yàn)為后續(xù)的柱層析色譜分