大鼠頸椎骨折錯位脊髓損傷模型的行為學和組織學實驗研究.pdf

1、背景：
　　 在臨床上常見骨折脫位后脊髓剪切導致的急性脊髓損傷，其中頸脊髓損傷占17.75％～50％。目前脊髓損傷的動物研究多采用嚙齒類動物，主要模型有切割、挫傷、壓迫等。2005年Fiford首次研究了胸椎橫向骨折錯位對脊髓損傷的原發(fā)性損傷的影響。加拿大學者choo于2007年首次建立了脊柱骨折錯位脫位脊髓損傷模型，發(fā)現(xiàn)C4和C5骨折錯位2.5mm下的脊髓原發(fā)性損傷與挫傷導致的脊髓損傷不同。Shahrokni研究了該種模型在C

2、5/6水平骨折錯位1.50mm后大鼠頸椎固定的生物力學，但是并沒有脊髓損傷的組織學和行為學的研究。
　　 我們前期研究了C4-C5骨折錯位1.3，1.6和1.9mm的大鼠原發(fā)性脊髓損傷，所以本課題進一步研究其繼發(fā)性損傷，包括傷后8周內的組織學改變和行為學特點。從行為學組織病理學兩方面對該模型進行分級，為該模型的應用研究提供基礎。
　　 目的：
　　 本課題將建立不同頸椎骨折錯位位移的大鼠原發(fā)性脊髓損傷模型，并在此

3、基礎上分析不同錯位位移下的脊髓損傷大鼠的行為學改變和組織學特點。
　　 研究設計：
　　 本研究共采用42只雄性SD大鼠（體重300g左右），根據(jù)C4/5錯位位移分為對照組，1.65mm組和1.80mm組，分兩個時間點進行研究，即原發(fā)性損傷研究（損傷后即刻處死）和繼發(fā)性損傷研究（8周觀察）。
　　 1.不同錯位位移下的脊髓原發(fā)性損傷研究本部分使用18只雄性SD大鼠，體重300g～335g，隨機分為頸椎骨折錯位1.

4、65mm組，頸椎骨折錯位1.80mm組和對照組，每組6只。磨鉆去除C4/5雙側小關節(jié)。頭側椎夾置于C2（下1/2）、C3和C4兩側溝槽（關節(jié)突與橫突間）中，尾側椎夾置于C5、C6和部分C7的兩側溝槽內。頭側椎夾固定于大鼠腦立體定位儀上，尾側椎夾連接到Instron單軸電磁伺服試驗機，以200mm/s速度向背側提升尾側椎夾1.65mm或者1.80mm，停留0.3s，然后以2mm/s的速度回到原位。試驗機記錄實驗組損傷過程中的力和位移。

5、r>　　 即刻灌注取材，樣本大體觀察和冰凍矢狀位切片HE染色，計算脊髓白質出血量、灰質出血量、以及總出血量。
　　 2.不同錯位位移下的頸髓繼發(fā)性損傷研究本部分使用24只雄性大鼠，體重288-330g，分對照組(n=6)，1.65mm組(n=9)和1.80mm組(n=9)。進行相應骨折錯位后，固定夾固定頸椎，飼養(yǎng)8周，進行行為學和組織學觀察。
　　 2.1 行為學研究前肢運動評分:FLS(Forelimb locomo

6、tor score)評分，在術前1天，術后第3和7天，以及術后第1至8周進行開場環(huán)境下錄像，用FLS評分評價大鼠脊髓損傷后的上肢功能改變。
　　 梳理實驗:在術前1天，術后1-8周，每周一次誘發(fā)大鼠自主梳理，進行錄像，評價大鼠上肢運動范圍。
　　 抓力試驗:在術前適應一周后，術前1天測量基線值，術后第4天，以及術后第1至8周時分別測量大鼠的左、右上肢拉力，評價前肢肌力變化。
　　 2.2 組織學研究灌注取材在術后

7、8周，即試驗終點時，過量麻醉處死大鼠，多聚甲醛心臟灌注，取C4/5為中心的長約7mm頸段脊髓，蔗糖溶液梯度脫水，干冰速凍，-80℃保存。
　　 行脊髓橫斷面切片，厚度20μm，間隔400μm，取其中10套切片待用，-80℃保存。隨機抽取4套，分別做HE染色觀察脊髓大體形態(tài)，LFB髓鞘染色檢測脊髓損傷后脫髓鞘情況，NISSL染色計數(shù)運動神經元數(shù)目，以及GFAP免疫組化染色分析膠質反應情況。
　　 結果：
　　 1.

8、不同錯位位移下的原發(fā)性脊髓損傷研究1.65mm組的大鼠頸椎骨折錯位最大力（可視為頸椎間盤斷裂時的拉力）為(16.45±3.56)N，1.80mm組為(15.57±5.73)N。1.65mm組和1.80mm組的錯位速度分別為(199.4±1.7) mm/s和(201.5±2.0) mm/s。
　　 兩組最大力的差異沒有顯著性(P=0.756)。兩組的實際位移均極為接近目標位移。1.80mm組速度與1.65mm組速度兩組間差異無顯著

9、性(P=0.084)。
　　 脊髓出血量計算:1.65mm組和1.80mm組兩組的白質出血量分別為(0.01±0.02) mm3和(0.09±0.05)mm3，兩組的灰質出血量為(0.58±0.15) mm3和(0.88±0.21)mm3，灰質和白質出血量兩組之間差異均有顯著性(P白質=0.013，P灰質=0.017)。
　　 2.不同錯位位移下的頸髓繼發(fā)性損傷研究()行為學前肢運動功能FLS評分:1.65mm組和1.8

10、0mm組術后第1天均表現(xiàn)為無或僅有一個關節(jié)輕微活動，F(xiàn)LS評分分別為(0.8±0.4)和(0.2±0.4)，組間差異無顯著性(P=0.810)。術后1周時，1.65mm組的評分分別為(3.0±1.9)，有兩個關節(jié)（即肩關節(jié)，肘關節(jié)）的輕微運動，而1.80mm組的評分(6.5±3.0)，有兩個關節(jié)（肩關節(jié)，肘關節(jié)）的中度活動有或無腕關節(jié)的輕微活動。大鼠脊髓損傷后，前肢運動功能在1-2周內恢復最快，在第3周時達到一個恢復平臺，評分分別為(1

11、2.2±1.5)和(10.6±1.5)，而后仍有少許恢復。1.65mm組和1.80mm組在術后第8周時前肢評分分別為(14.3±0.7)和(12.1±0.9)。除第1天外的各時間點上兩組評分的差異均有顯著性。
　　 梳理實驗:1.65mm組和1.80mm組術后1周評分最低，評分分別為(1.4±0.7和(1.1±0.8)。在術后第8周時，評分分別為(3.4±0.5)和(3.3±0.7)，大鼠前肢最大梳理范圍達眼框附近。在各個時間點

12、，兩組間評分差異均無顯著性。實驗對照組為滿分5分。
　　 前肢拉力:術前對照組、1.65mm組和1.80mm組的拉力分別為(1.64±0.08)N、(1.59±0.11)N和(1.63±0.08)N。1.65mm組和1.80mm組術后1周內表現(xiàn)爪子痙攣或者無力狀態(tài)，在第1周時有輕微抓力，分別為（0.49±0.18）N和（0.83±0.13）N，兩組間的差異有顯著性(p＜0.05)。實驗對照組術后第1周的拉力為(1.44±0.20

13、)N。1.65mm組和1.80mm組從第1周后隨時間逐漸恢復，在第8周時分別為(1.55±0.24)N和(1.39±0.16)N，均小于實驗對照組(1.87±0.13)N。在各個時間點上，三組的左、右側拉力的差異無顯著性，說明脊髓損傷的對稱性較好。
　　 組織學結果
　　 脊髓損傷后，逐漸形成空洞囊腔，脊髓萎縮，HE染色照片可以觀察到脊髓明顯萎縮變小。脊髓損傷8周時，1.65mm組脊髓損傷中心處脊髓殘留面積為(3.24±

14、0.82) mm2，1.80mm組為(2.15±0.51)mm2。1.65mm組以損傷處為中心的長度為4mm的脊髓體積為(18.07±2.31) mm3，1.80mm組為(16.01±2.34)mm3，對照組為(25.38±1.05) mm3。三組間脊髓體積的差異均有顯著性。骨折錯位越大，損傷程度越重，脊髓殘留體積越小。
　　 脊髓損傷第8周時，GFAP免疫組化染色后的組織切片上可見灰質和白質中均膠質細胞明顯增生，特別是在空洞囊

15、腔的邊緣可見大量膠質細胞浸潤，呈灶性聚集分布。白質和灰質中膠質細胞形態(tài)胞體變大，突觸減少。1.80mm組可見膠質反應明顯重于1.65mm組。對照組的膠質細胞細小，白質中神經小膠質數(shù)目少，胞體小，突觸細長，未見明顯的膠質活性增生及其他異常等。
　　 脊髓脫髓鞘，在Luxol fast blue染色切片上，計算以脊髓損傷中心為中點，頭、尾端各2mm，4mm長的脊髓共計11片切片上的髓鞘LFB染色的總IOD值。對照組總IOD值為(2.

16、87±0.34)×105，1.65mm組為(1.14±0.33)×105，而1.80mm組為(0.54±0.30)×105。1.65mm組和1.80mm組均與對照組的差異均有顯著性(P=0.000)，而1.65mm組的總IOD值大于1.80mm組(P=0.027)。結果表明:骨折錯位位移越大，脊髓白質髓鞘脫失越嚴重。距離脊髓損傷中心尾端1.6mm處的脊髓切片為例，可見實驗組在脊髓損傷區(qū)域的尾端的背側和腹側的髓鞘均有明顯脫失。而1.80m

17、m組不論在脊髓背側還是腹側的髓鞘脫失都比1.65mm組嚴重。
　　 尼氏染色后，在脊髓損傷中心神經元細胞的丟失最為明顯，該處1.65mm組和1.80mm組的運動神經元幾乎被破壞殆盡。距頭尾端2mm的脊髓，1.65mm組運動神經元細胞數(shù)目少于1.80mm組運動神經元數(shù)目，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.045）.以距離損傷中心1.2mm為例，1.80mm組在脊髓前角上部?？梢娒黠@增生的神經膠質細胞聚集，可見明顯神經元細胞固縮變形或胞體淡