人睪丸特異表達(dá)基因TDRG1編碼蛋白質(zhì)功能的初步研究.pdf

1、男性不育發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程，近年來發(fā)現(xiàn)有很多基因參與了這一過程，其中有不少基因的功能已被明確。這些已知的基因如何與其它的基因相互作用來調(diào)控精子的生成過程，以及是否存在其它的未知基因參與精子的發(fā)生目前尚不完全清楚。因此克隆新的睪丸發(fā)育、生精相關(guān)基因并進(jìn)一步闡明其功能是了解生殖細(xì)胞發(fā)生機(jī)理和生物學(xué)過程的關(guān)鍵，對闡明精子的發(fā)生的生理、病理具有重要意義。
　　 我院泌尿外科長期以來致力于男性不育領(lǐng)域的臨床和基礎(chǔ)方面的研

2、究，并積累了豐富的研究資料。2005年我科蔣先鎮(zhèn)、陽建福等采用生物信息學(xué)分析結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法克隆了一個(gè)在人類睪丸組織中特異性高表達(dá)的新基因(GenBank登錄號為DQ168992)，命名為TDRG1(Testis Development Related Gene1)。生物信息學(xué)預(yù)測表明，TDRG1基因含有303bp(504 bp-806bp)的完整開放閱讀框(OpenReading Frame，ORF)，編碼100個(gè)氨基酸。前期我們對

3、TDRG1基因在人多種組織中的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因僅在正常青春期及成年男性睪丸中高表達(dá)，而在其他組織中無明顯表達(dá)，表明它是一個(gè)在人睪丸組織中特異表達(dá)的基因，提示它可能與睪丸的功能有關(guān)系。同時(shí)我們利用半定量RT-PCR法分析TDRG1基因在人類睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TDRG1在4個(gè)月和6個(gè)月的胎兒睪丸中無表達(dá)，在15歲少年睪丸中強(qiáng)表達(dá)，在33歲青年睪丸中表達(dá)稍減弱，而在74歲老年男性睪丸組織中的表達(dá)明顯減弱，進(jìn)一步提

4、示TDRG1與生精功能以及男性性成熟有關(guān)。
　　 為了明確TDRG1的功能，我們進(jìn)行了深入的研究。本課題獲得國家自然科學(xué)基金資助(項(xiàng)目編號30672090)，課題由以下五部分組成。
　　 第一章人睪丸基因TDRG1在不同物種間同源序列的分析。
　　 目的：克隆人類睪丸特異基因TDRG1在不同物種間的同源序列，為研究該基因功能尋找動(dòng)物模型。
　　 方法：以人TDRG1基因全長序列作為查詢序列，利用BLAST

5、N軟件檢索小鼠、大鼠和黑猩猩基因組數(shù)據(jù)庫。RT-PCR和免疫組化染色初探TDRG1在不同物種間同源基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：生物信息學(xué)分析表明小鼠和大鼠基因組中未檢索到與TDRG1同源的序列，而黑猩猩基因組中有相似性為98％的同源序列存在。RT-PCR和免疫組化染色檢測結(jié)果也表明小鼠和大鼠睪丸中無同源序列和同源蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：TDRG1基因在小鼠和大鼠睪丸中無同源基因及蛋白表達(dá)，而在黑猩猩睪丸中有同源序列存在，為

6、今后建立動(dòng)物模型提供了理論依據(jù)。
　　 第二章人睪丸特異基因TDRG1單克隆抗體的制備及鑒定。
　　 目的：構(gòu)建原核質(zhì)粒表達(dá)TDRG1重組蛋白，免疫小鼠制備單克隆抗體(mAb)，并鑒定其生物學(xué)特性；
　　 方法：用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法從成人睪丸組織中擴(kuò)增TDRG1編碼序列，將其克隆到pET21原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)TDRG1重組蛋白。以純化后的重組蛋白免疫BALB/C小鼠，利用雜

7、交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備抗TDRG1的mAb。用Western Blot法和免疫組化染色法鑒定mAb的特異性，用間接ELISA法檢測mAb腹水效價(jià)；
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pET21/TDRG1原核表達(dá)質(zhì)粒，得到了純度較高的重組蛋白。免疫小鼠后獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗TDRG1的mAb雜交瘤細(xì)胞系，WB結(jié)果顯示該單克隆抗體特異識別TDRG1和睪丸組織提取裂解液，免疫組化結(jié)果顯示該蛋白定位于睪丸各級生精細(xì)胞胞漿，腹水mAb效價(jià)高達(dá)1:1

8、.6×106；
　　 結(jié)論：所獲得的重組TDRG1蛋白純度高，免疫抗原性強(qiáng)，成功制備了抗TDRG1的mAb，為進(jìn)一步研究TDRG1基因功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章 TDRG1蛋白在多組織中的表達(dá)分析及功能初探。
　　 目的：從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證TDRG1在人睪丸組織中的表達(dá)，探討TDRG1蛋白在人不同組織以及不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達(dá)情況，初步探明TDRG1蛋白的功能；
　　 方法：使用免疫組化染色法確定

9、TDRG1蛋白在人睪丸組織中的表達(dá)，免疫組化染色確定TDRG1蛋白在人多種組織中的表達(dá)情況，Real-time PCR和免疫組化染色確定TDRG1在人不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達(dá)水平；
　　 結(jié)果：TDRG1蛋白特異地表達(dá)于人睪丸組織，在心、肝臟、脾臟、胃、結(jié)腸、直腸、食道等正常組織中無表達(dá)。免疫組化染色顯示TDRG1蛋白的表達(dá)定位于人睪丸的曲細(xì)精管中，在生精細(xì)胞上有明確的陽性表達(dá)，而在基底膜和精子細(xì)胞中未見明顯表達(dá)；免疫組化染

10、色顯示了TDRG1蛋白在成人睪丸組織中高表達(dá)，在老年睪丸組織中表達(dá)減弱。Real-time PCR結(jié)果亦顯示TDRG1基因在成年人睪丸中高表達(dá)，而在老年人睪丸組織中表達(dá)減弱，在胎兒睪丸中表達(dá)極低；
　　 結(jié)論：本研究從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了TDRG1基因在睪丸組織中的表達(dá)，TDRG1為睪丸特異表達(dá)蛋白，表達(dá)于人生精細(xì)胞，參與精子的生成。
　　 第四章 TDRG1蛋白在睪丸腫瘤發(fā)生中的作用。
　　 目的：探討人睪丸基因T

11、DRG1在睪丸腫瘤組織中的蛋白表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義；
　　 方法：運(yùn)用組織芯片技術(shù)、免疫組化法檢測人睪丸特異基因TDRG1在睪丸腫瘤組織和正常睪丸組織中的表達(dá)；
　　 結(jié)果：TDRG1蛋白在精原細(xì)胞瘤和睪丸畸胎瘤中的表達(dá)較正常人睪丸對照組顯著降低(P<0.05)，而在睪丸胚胎癌、睪丸卵黃囊瘤、睪丸結(jié)核和睪丸萎縮組織中的表達(dá)較正常人睪丸對照組降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(P>0.05)；
　　 結(jié)論：TDRG1蛋

12、白的表達(dá)降低與睪丸腫瘤的發(fā)生明顯相關(guān)，推測TDRG1蛋白的功能可能與抑制某些類型的睪丸腫瘤發(fā)生相關(guān)，TDRG1可能是候選的抑癌基因。
　　 第五章人睪丸基因TDRG1重組真核載體的構(gòu)建及其表達(dá)。
　　 目的：構(gòu)建人睪丸基因TDRG1的真核表達(dá)質(zhì)粒，并研究其表達(dá)；
　　 方法：取人新鮮正常睪丸組織，提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶聯(lián)鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增TDRG1基因編碼序列；將該基因克隆到真核表達(dá)載體pYD5

13、中，構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體pYD5-TDRG1，用限制性內(nèi)切酶酶切分析及DNA序列分析鑒定重組質(zhì)粒；將測序正確的重組質(zhì)粒pYD5-TDRG1在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，間接免疫熒光法和Western Blot法鑒定目的蛋白質(zhì)的表達(dá)；
　　 結(jié)果：RT-PCR擴(kuò)增出TDRG1基因編碼序列，目的插入片段長約303bp；產(chǎn)物行限制性內(nèi)切酶酶切后連接到真核表達(dá)載體pYD5，重組質(zhì)粒pYD5-TDRG1經(jīng)酶切及DNA測序鑒定構(gòu)建成功；該質(zhì)