版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、哺乳動物的精子發(fā)生是一個復雜而獨特的細胞增殖與分化的過程,其中包括精原細胞的有絲分裂增殖,精母細胞的減數(shù)分裂和精子細胞的變態(tài)過程,最終形成成熟的精子。精子發(fā)生過程涉及復雜的形態(tài)變化、遺傳重組及染色體倍數(shù)的減半。這一過程是一個受到精細調(diào)節(jié)的眾多基因參與的復雜而有序的過程。因此,篩選和研究精子發(fā)生過程中起重要作用的特異表達基因,對研究精子發(fā)生的分子機制,探討男性不育的分子機理,尋找新的診斷和治療措施及研究新的節(jié)育手段具有重要意義。
2、 LM23基因是本實驗室克隆出的一條新基因,前期的初步研究提示,它是一個新的大鼠精子發(fā)生相關基因。BLAST工具對LM23基因的同源基因進行比對分析發(fā)現(xiàn),LM23基因與小鼠、人類的speedy homolog A(Spdya,Speedy)基因具有同源性。本研究對該基因在精子發(fā)生過程中的明確作用及其機制進行了探討。
首先我們對該基因的表達特性進行了進一步的鑒定。利用RT-PCR檢測了LM23基因在正常大鼠的心、肝、脾、
3、肺、腎、腦、卵巢、睪丸、肌肉組織中的表達,結(jié)果顯示睪丸組織有較高水平的LM23基因表達,其余組織均為陰性,從而提示LM23基因的表達具有睪丸特異性。分離9天齡雄性SD大鼠A型精原細胞及成年大鼠粗線期精母細胞和圓形精子細胞進行熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示該基因在精母細胞中表達量最高,顯著高于精原和精子細胞的表達量;原位雜交檢測結(jié)果也提示LM23基因主要在精母細胞中表達。這些結(jié)果說明LM23基因的表達具有組織特異性和階段特異性的特點。
4、> 為了探討LM23基因在精子發(fā)生中的功能,本研究針對LM23基因序列,設計了4個RNA干擾靶點序列,克隆到慢病毒載體上,篩選出含目的序列的慢病毒載體,包裝成病毒顆粒。選5周齡的雄性SD大鼠為研究對象,經(jīng)睪丸輸出管注射法將上述包裝好的病毒顆粒注射到睪丸。實驗組注射液中含干擾片段病毒,對照組含無關片段病毒,單側(cè)注射,未注射側(cè)睪丸作為空白對照。注射后4周,拉頸處死大鼠,開腹取出睪丸。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射干擾病毒的睪丸比對照側(cè)右側(cè)睪丸略小,且
5、附睪也沒有右側(cè)附睪飽滿;而注射對照病毒的睪丸與對側(cè)睪丸比較無明顯差異。在體式熒光顯微鏡下觀察,可見已經(jīng)在大鼠睪丸表達慢病毒載體的綠色熒光蛋白。在熒光顯微鏡下觀察睪丸冰凍切片,顯示生精上皮細胞中有綠色熒光表達,說明慢病毒顆粒已成功轉(zhuǎn)染生精細胞。Real-time PCR檢測注射后2周和4周的實驗組、對照組和空白對照組睪丸LM23的表達,結(jié)果顯示實驗組LM23的表達顯著降低,與對照組比較,2周和4周表達量分別減低了69%和87%。通過Wes
6、tern blot方法檢測干擾側(cè)大鼠組睪丸中LM23蛋白的表達情況,結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)RNA干擾大鼠睪丸未LM23蛋白表達。這些結(jié)果提示成功建立LM23基因沉默大鼠模型。
睪丸組織切片HE染色檢查,結(jié)果顯示干擾側(cè)睪丸的精曲小管組織紊亂,有斷裂和生精細胞脫落至管腔的現(xiàn)象,生精細胞發(fā)育阻滯在精母細胞階段。鏡下大約可以觀察到三種類型的精曲小管,在Ⅰ型管中含有3-4層的精母細胞;在Ⅱ型管中含更多的精母細胞,并且細胞有向管腔中脫落的現(xiàn)象
7、,管腔中有伊紅染色很重的細胞;在Ⅲ型管腔中僅有1-2層精原細胞和支持細胞,管腔空洞。對照側(cè)附睪中充滿成熟精子,而干擾側(cè)附睪管的管腔縮小,未見成熟精子。TUNEL檢測LM23基因沉默后睪丸顯示,在一些精曲小管中有大量的凋亡細胞存在,而這些精曲小管與上述提到的Ⅱ型管基本對應,而在對應的Ⅰ型管腔和Ⅲ型管腔中存有少量的凋亡細胞,而在對照側(cè)睪丸則幾乎未檢測到凋亡細胞。根據(jù)這些結(jié)果推測,LM23基因沉默通過某種機制引起精子發(fā)育到精母細胞階段發(fā)生阻滯
8、,造成了精母細胞在精曲小管中堆積,出現(xiàn)了Ⅰ型管中所觀察到的現(xiàn)象。由于這些精母細胞不能繼續(xù)分化可能啟動了凋亡通路而發(fā)生凋亡,出現(xiàn)了Ⅱ型管中所觀察到的現(xiàn)象;最后由于凋亡細胞被清除而出現(xiàn)了Ⅲ型管中所觀察到的現(xiàn)象。
為了探討LM23基因的作用機制,本研究利用大鼠全基因組芯片篩查LM23基因沉默引起的睪丸表達譜的改變狀況,并對所得數(shù)據(jù)進行驗證和分析?;蛐酒Y(jié)果分析顯示,LM23基因沉默大鼠睪丸發(fā)生大量的基因表達改變,其中包括多個精
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 睪丸特異表達蛋白SPAG8的性質(zhì)和功能研究.pdf
- 小鼠睪丸發(fā)育過程睪丸特異基因表達與不育的研究.pdf
- 人類睪丸特異表達新基因MAEL的克隆和表達分析.pdf
- 人類睪丸特異表達新基因HMGB4的分離鑒定和初步功能分析.pdf
- 人睪丸特異表達基因家族VCX-Y編碼蛋白功能的初步研究.pdf
- 人睪丸特異基因hsd3.8功能的初步研究
- 小鼠睪丸特異性表達新基因TSEG-2的功能初步分析.pdf
- 人睪丸特異表達基因TDRG1編碼蛋白質(zhì)功能的初步研究.pdf
- 53201.人睪丸特異表達基因hsd3.8編碼蛋白質(zhì)的功能研究
- 58072.睪丸特異基因bs63功能的初步研究
- 人和小鼠睪丸特異性表達基因譜分析.pdf
- 50595.小鼠睪丸特異表達新基因mtlr1及胚胎干細胞特異表達新基因mhemk的克隆及初步功能研究
- 人睪丸特異表達基因TDRG1 shRNA表達載體的構(gòu)建及其表達.pdf
- 睪丸組織高表達基因fancd2os的細胞特異性分析及初步功能研究.pdf
- 小鼠睪丸特異性miR-471的表達及功能初步研究.pdf
- 人睪丸特異轉(zhuǎn)錄本基因(PRC-T)的克隆和研究.pdf
- 人肝臟特異表達基因TCP10L的克隆和功能研究.pdf
- 睪丸特異蛋白激酶TSSK4的基因克隆及功能初探.pdf
- 靈長類特異表達基因TCP10L的功能研究.pdf
- 水稻和玉米組織特異表達基因的克隆及功能分析.pdf
評論
0/150
提交評論