BmDaxx基因?qū)倚Q細(xì)胞及幼蟲組織凋亡的調(diào)控作用.pdf

1、Daxx（死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白）是一種具有多種生物功能的核蛋白。Daxx最初被鑒定為具有調(diào)控凋亡信號途徑的功能分子和與Fas的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain of Fas，F(xiàn)asDD)發(fā)生相互作用的蛋白。其可定位于核仁、核質(zhì)、胞質(zhì)、早幼粒細(xì)胞和異染色質(zhì)中。Daxx特異地與Fas死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合，過表達(dá)Daxx增強(qiáng)了Fas介導(dǎo)的凋亡，并且激活了JNK通路。Daxx的C端與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，而另外一個結(jié)構(gòu)域則激活JNK通路。Dax

2、x不僅在細(xì)胞凋亡途徑中起著非常重要的作用，同時也參與許多疾病的調(diào)節(jié)，如在腫瘤和白血病的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。然而Daxx在昆蟲和哺乳動物的作用有一些不同。BmDaxx在家蠶中調(diào)節(jié)死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路的分子機(jī)制仍然不清楚，BmDaxx與上下游基因的相互作用也仍然沒有報道。
　　本研究主要包括以下6個部分的內(nèi)容:
　　(1)克隆并鑒定了家蠶BmDaxx基因，并且對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測蛋白大小為67.74KDa。

3、　　(2)在BmN細(xì)胞系中進(jìn)行BmDaxx基因的過表達(dá)和siRNA干擾實驗，并檢測caspase-3激活數(shù)，同時利用短波紫外線(UVC)和放線菌素D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在這不同的誘導(dǎo)情況下，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率。實驗數(shù)據(jù)表明，當(dāng)BmDaxx基因表達(dá)量增高時，能夠引起caspase-3酶活性的增高，流式細(xì)胞術(shù)檢測的凋亡率也相應(yīng)升高。而當(dāng)BmDaxx基因的表達(dá)由三條不同靶點的siRNA干擾后，caspase-3的激活數(shù)有所下降，紫外線誘導(dǎo)

4、的細(xì)胞凋亡率沒有明顯區(qū)別，然而放線菌素D誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率沒有降低反而有一些升高，但沒有達(dá)到顯著性差異。
　　(3)通過在BmN細(xì)胞中過表達(dá)和干擾BmDaxx基因，同時檢測另外的凋亡相關(guān)基因BmFadd和BmDredd的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmFadd和BmDredd的表達(dá)量變化趨勢與BmDaxx的表達(dá)量變化趨勢一致。用caspase-3抑制劑處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)這三個基因的轉(zhuǎn)錄水平都有明顯下降，因此推測BmDaxx、BmFadd和BmDre

5、dd在同一條凋亡通路間存在相互關(guān)系，并且為正相關(guān)。
　　(4)實時熒光定量PCR檢測BmDaxx基因在家蠶不同生長時期、不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在家蠶吐絲時的絲腺中表達(dá)量開始顯著升高，在吐絲36小時時的絲腺中表達(dá)量達(dá)到高峰，特別是在后部絲腺中的表達(dá)量達(dá)到最高。這與家蠶絲腺的發(fā)育變化情況一致。這表明BmDaxx參與了家蠶變態(tài)發(fā)育過程中絲腺的退化。
　　(5)用caspase抑制劑處理家蠶BmN細(xì)胞，并在吐絲時

6、對家蠶進(jìn)行體內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)在caspase抑制劑處理的BmN細(xì)胞中caspase-3酶活性有顯著的降低，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率也有明顯下降，BmDaxx，BmFadd和BmDredd三個基因的表達(dá)量也有明顯降低。在注射caspase抑制劑的家蠶中，BmDaxx、BmFadd和BmDredd的轉(zhuǎn)錄水平也有明顯降低。因此推測這三個基因在細(xì)胞和個體水平上都相互作用并同時參與凋亡通路。
　　(6)在BmN細(xì)胞和家蠶絲腺中定位了BmDaxx

7、蛋白。用放線菌素D處理BmN細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，通過共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡時BmDaxx蛋白在細(xì)胞中位置的變化。用石蠟切片的方法觀察BmDaxx蛋白在五齡第3天時與表達(dá)量最高的吐絲36小時的絲腺中的變化。發(fā)現(xiàn)當(dāng)用放線菌素D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時，BmDaxx蛋白發(fā)生遷移，更多的從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。而家蠶絲腺中在吐絲36小時的絲腺凋亡最為激烈的時期相對于五齡3天時BmDaxx蛋白的表達(dá)量更多，這也與之前熒光定量測得的BmDaxx基因的表達(dá)量相一致