AuroraB激酶在家蠶細胞周期中的調(diào)控作用研究.pdf

1、AuroraB激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，是染色體乘客復合物（CPC）的催化亞基。哺乳動物中的研究表明，Aurora B激酶是細胞有絲分裂過程中染色體濃縮與定位、姐妹染色體分離以及胞質(zhì)分裂必不可少的調(diào)控因子。Aurora B激酶在哺乳動物細胞周期進程中的功能研究已有豐富積累，在家蠶等昆蟲中的研究極少。我們在本研究中對家蠶Aurora B激酶（BmAurB）基因進行了全長cDNA序列克隆和表達譜分析，利用RNAi等技術(shù)分析了BmA

2、urB在家蠶細胞周期中的功能，并利用標記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學策略對Aurora B激酶的底物蛋白進行了鑒定分析。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用果蠅Aurora B基因的氨基酸序列在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)家蠶預(yù)測基因BGIBMGA002350與果蠅Aurora B高度同源。以此為基礎(chǔ)，進一步利用5’和3’RACE方法克隆得到家蠶Aurora B激酶（BmAurB）基因的全長cDNA序列（GenBank access

3、ion number：KX420635）。BmAurB基因全長為1090bp，135-1005bp區(qū)域是開放閱讀框，共編碼289個氨基酸。將全長cDNA序列與家蠶基因組序列進行比對發(fā)現(xiàn)，BmAurB基因有6個外顯子和5個內(nèi)含子。利用在線SMART程序預(yù)測發(fā)現(xiàn)BmAurB基因的氨基酸序列含有一個保守的起磷酸化作用的S_Tkc結(jié)構(gòu)域。⑵利用雙鏈 RNA瞬時干涉及特異抑制劑處理等方法降低家蠶卵巢來源的BmN4-SID1細胞中的 BmAurB激

4、酶表達或活性，然后通過流式細胞分析來探索BmAurB激酶在細胞周期進程中的調(diào)控作用。結(jié)果表明，針對BmAurB的雙鏈RNA瞬時干涉及特異抑制劑處理都會使細胞周期被阻斷在G2/M期，并引起DNA含量大于4N的細胞的積累。進一步利用免疫熒光染色方法觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，在BmAurB激酶的表達或活性降低后，細胞有絲分裂前中期可發(fā)生染色體遷移異常，以至于中期出現(xiàn)染色體位置錯亂而不能整齊排列在赤道板上；有絲分裂后期姐妹染色單體不能正常分離而形成染色

5、體橋，或發(fā)生不均等分離；胞質(zhì)分裂被阻滯，兩個子細胞不能分離而生成雙核細胞。進一步的Western Blot實驗表明，調(diào)控G2/M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白CDK1以及標記處于分裂期細胞的磷酸化組蛋白H3（pH3）的磷酸化水平隨著BmAurB激酶活性下降而降低。上述結(jié)果表明BmAurB激酶活性降低嚴重阻礙了家蠶的細胞周期進程。⑶基于同位素標記的定量磷酸化蛋白質(zhì)組學策略對Aurora B激酶新的潛在作用靶標進行了鑒定分析。鑒于家蠶細胞周期難于同步化，

6、我們擬用人胚腎來源的HEK293-FT細胞進行該研究。首先利用CDK1抑制劑RO3306對HEK293-FT細胞進行同步化處理，使大部分細胞停滯在G2期。然后更換培養(yǎng)基，一部分細胞用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)（對照組），一部分細胞用添加了Aurora B抑制劑AZD1152-HQPA的培養(yǎng)基培養(yǎng)（實驗組），每組實驗設(shè)3個重復；當培養(yǎng)40 min的對照組細胞進入有絲分裂中期時，即刻收集對照組和實驗組細胞，并分離純化總蛋白。Western blot分析

7、顯示，AZD1152-HQPA抑制劑處理導致細胞中H3的磷酸化水平降低。對實驗組和對照組的每個蛋白樣品進行胰酶消化后，利用TiO2方法富集待測樣品中的磷酸化肽段，再通過標記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)對磷酸化肽段進行鑒定分析。從實驗組和對照組的6個樣品中，我們共鑒定到8903個磷酸肽段，通過數(shù)據(jù)庫比對將這些肽段匹配到3364個磷酸化蛋白。根據(jù)差異倍數(shù)≥1.2或者≤0.83以及p值＜0.05的通用參數(shù)，我們對鑒定到的磷酸化肽段進行定量分析并發(fā)

8、現(xiàn)，16個磷酸化蛋白的25個磷酸化肽段發(fā)生上調(diào)，32個磷酸化蛋白的36個磷酸化肽段發(fā)生下調(diào)。GO分類顯示，這些差異磷酸化蛋白均具有催化活性，主要參與信號傳導和細胞周期進程等生物學過程。除了H3和H1等已經(jīng)證實為Aurora B的磷酸化底物蛋白外，我們新發(fā)現(xiàn)參與維持染色體結(jié)構(gòu)的 CBX5以及微管結(jié)合蛋白RP/EB等可能是 Aurora B的磷酸化靶蛋白。進一步利用 RNAi方法降低BmN4-SID1細胞中的CBX5基因表達量，出現(xiàn)胞質(zhì)分裂