家蠶凋亡相關基因ice的克隆表達及對病毒感染家蠶細胞的影響.pdf

1、ICE(白細胞介素-1β轉換酶)是Caspase家族(半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶cys-teinylaspartate specific proteinase)中最早發(fā)現(xiàn)的成員，在多細胞生物的程序性細胞死亡中起著重要的作用。到目前為止，已有11種人的，10種鼠的，4種鳥和魚的，8種兩棲類的，7種昆蟲和3種線蟲的Caspase得到了解析。但是在基因庫中公布的家蠶ice類似基因序列(GenBank登錄號為：AY885228)僅為一條，其功能未

2、知。本研究根據(jù)這個ice基因設計特異引物，從家蠶細胞中獲得了不同于ice的兩個新基因，分別命名為ice-2和ice-5(GenBank登錄號分別為：DQ360829，DQ360830)。它們的讀碼框分別為852和936 bp，編碼284和312個氨基酸。對ice，ice-2和ice-5序列分析得知這3個基因之間既有相同之處也存在著差異。ice和ice-2都含有7個外顯子，而ice-5含8個外顯子，它們的前5個外顯子和最后1個外顯子相同。

3、ice和ice-2的差別之處在第6個外顯子的中間處，ice-2比ice多出30個堿基。 ICE家族的蛋白成熟過程中會發(fā)生自我酶解，為了了解ICE-2和ICE-5的酶解方式，本研究利用了能穩(wěn)定表達蛋白的大腸桿菌表達系統(tǒng)，分別采用高溫37℃和室溫25℃的條件誘導表達了ICE-2和ICE-5。在37℃誘導前期ICE-2和ICE-5不發(fā)生酶解，分別在33 kD和36 kD處有明顯條帶；在誘導3 h后，ICE-2除了33 kD處有特異條

4、帶外，23 kD處也出現(xiàn)了特異帶，而ICE-5無變化。推測過量ICE-2發(fā)生部分自我酶解現(xiàn)象。在25℃條件誘導下，ICE-5只在26 kD處有特異條帶，而ICE-2檢測不到條帶，推測ICE-2和ICE-5的酶解方式不一樣。 為了研究獲得的ice-2和ice-5在凋亡通路中的作用，采用紫外線刺激家蠶幼蟲和細胞、過氧化氫和病毒刺激家蠶細胞，利用熒光定量PCR的方法檢測不同因素刺激下ice-2和ice-5的表達量變化。檢測結果得知：

5、在低劑量的紫外線刺激的家蠶幼蟲和細胞中，ice-2的表達量在某個刺激時間點上有高表達，而ice-5的表達量無明顯變化，說明ice-2可能與修復機制有關。在高劑量的紫外線刺激的家蠶幼蟲和細胞中，ice-5的表達量變化比ice-2的明顯。在過氧化氫刺激及病毒感染的家蠶細胞中ice-2和ice-5的表達量隨著刺激劑量的增加都發(fā)生變化，ice-5的表達量變化的更明顯。說明ice-2和ice-5都參與細胞凋亡的執(zhí)行，ice-5比ice-2起更重要

6、的作用。 通過桿狀病毒表達系統(tǒng)研究了過量表達ice-2和ice-5對病毒感染家蠶細胞的影響。將ice-2和ice-5基因分別克隆到表達載體HTB，然后轉化BmDH10Bac感受態(tài)細胞，經抗生素及藍白斑篩選得到重組桿粒Bacmid-ICE-2和Bacmid-ICE-2，通過pUC/M13引物的PCR結果顯示這兩個重組桿粒為陽性克隆。將該桿粒轉染家蠶Bm細胞，得到病毒粒子r-ice-2和r-ice-5。以ice-2及ice-5基因

7、的序列設計引物，進一步對病毒粒子DNA進行PCR鑒定，結果證明病毒含ice-2及ice-5基因。將病毒粒子感染Bm細胞，采用形態(tài)觀察、細胞存活率計數(shù)、DNA Ladder檢測DNA片段化等方法測定細胞的變化。試驗表明，ice-2和ice-5都能誘導細胞凋亡，ice-5比ice-2的誘導凋亡作用更明顯。 本研究從家蠶細胞中獲得了ice家族的兩個新基因，ice-2和ice-5。通過試驗證明ice-2和ice-5都與細胞信號轉導有關