家蠅幼蟲抗菌肽對肝癌HepG2細胞增殖及凋亡作用的研究.pdf

1、目的：
　　比較家蠅幼蟲、家蠅幼蟲抗菌肽純化物I1、I2、I3、I4及其粗提物對肝癌HepG2細胞增殖的影響，選擇對HepG2細胞抑制作用最強的組分進行體外抗腫瘤實驗，并探索其可能的抗腫瘤機制。
　　方法：
　　1.采用MTT法檢測家蠅幼蟲及家蠅幼蟲抗菌肽各組分對HepG2細胞增殖抑制的影響；
　　2.采用Hoechst33258熒光染色法觀察家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用后HepG2細胞核形態(tài)的改變；
　　3.

2、通過流式細胞術(shù)分別分析家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對HepG2細胞周期、細胞凋亡、線粒體膜電位及活性氧的影響。
　　4.通過激光共聚焦顯微鏡及流式細胞術(shù)共同觀察家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用后HepG2細胞內(nèi)Ga2+水平的變化。
　　5.采用分光光度法檢測家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用后HepG2細胞中Caspase3、Caspase9酶活性的改變。
　　6.采用Western blot檢測家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用后凋亡相關(guān)蛋白：Clea

3、ved Caspase3、Cleaved Caspase9、Bcl-2及Bax的表達情況；
　　結(jié)果：
　　1.MTT結(jié)果顯示：家蠅幼蟲抗菌肽粗提物及純化物I1、I2、I4在各時段均能明顯抑制HepG2細胞的增殖（P<0.05），且隨著時間的延長抑制效果愈加明顯；當(dāng)干預(yù)時間高于48 h后粗提物組的抑制率明顯高于其余各組（P<0.05），抑制效果最為顯著。不同濃度的家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對HepG2細胞均能產(chǎn)生明顯抑制作用（P<

4、0.01），且隨著濃度的增大抑制作用不斷增強，呈劑量依賴特性。
　　2.細胞周期檢測結(jié)果顯示：家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用后處于G0/G1期的HepG2細胞比例明顯升高（P<0.01），而S期和G2/M期細胞比例下降明顯。
　　3.細胞凋亡檢測結(jié)果顯示：家蠅幼蟲抗菌肽粗提物能夠明顯誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生凋亡。從形態(tài)學(xué)上看，粗提物作用后部分細胞發(fā)生核凝集、染色質(zhì)趨邊及核碎裂等典型凋亡形態(tài)學(xué)特征的改變，顏色發(fā)白呈亮藍色，而對照組細胞

5、核形狀規(guī)則，顏色分布均勻呈正常藍色；從凋亡率看，60、240及480 ug/mL的粗提物均能誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡（P<0.05），且隨著濃度的增大，凋亡率也不斷升高，呈劑量依賴性。
　　4.線粒體膜電位檢測結(jié)果顯示：家蠅幼蟲抗菌肽粗提物能夠改變HepG2細胞線粒體膜電位的平衡狀態(tài)，促進線粒體膜電位的下降。
　　5.鈣離子檢測結(jié)果顯示：家蠅幼蟲抗菌肽粗提物能夠明顯提高HepG2細胞內(nèi)的鈣離子濃度。激光共聚焦顯微鏡下：粗提物干

6、預(yù)后的各組細胞熒光強度明顯高于對照組，且對比細胞形態(tài)可以看出，變圓、皺縮的細胞鈣離子熒光強度明顯高于正常形態(tài)的細胞；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果同樣顯示：粗提物各組細胞內(nèi)的鈣離子平均熒光強度明顯高于對照組（P＜0.05），且隨著濃度的增大，鈣峰明顯右移，熒光強度逐漸增強。
　　6.ROS檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，240、480 ug/mL的家蠅幼蟲抗菌肽粗提物能夠促進HepG2細胞內(nèi)的ROS的釋放，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

7、r>　　7.Caspase酶活性檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，粗提物各組HepG2細胞內(nèi)Caspase3及Caspase9的酶活性均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　8.Western blot結(jié)果顯示：家蠅幼蟲抗菌肽粗提物能夠上調(diào)Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9及促凋亡蛋白Bax的表達，降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表達。
　　結(jié)論：
　　1.家蠅幼蟲抗菌肽粗提物及純化物

8、I1、I2、I4能夠明顯抑制HepG2細胞的增殖，其中粗提物的抑制效果最為明顯。
　　2.家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對HepG2細胞的抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)，可將HepG2的細胞周期阻滯于G0/G1期，可能通過影響DNA的復(fù)制和有絲分裂，抑制細胞增殖。
　　3.家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用后HepG2細胞內(nèi)ROS及鈣離子濃度的增加可能作為啟動細胞凋亡途徑的上游信號分子共同推動細胞凋亡的發(fā)生。
　　4.家蠅幼蟲抗菌肽粗提物可能通過