Hedgehog信號(hào)通路對(duì)家蠶脂肪細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、從脊椎動(dòng)物到無(wú)脊椎動(dòng)物，Hh信號(hào)通路廣泛存在并高度保守，在動(dòng)物胚胎多種組織器官的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Hh信號(hào)通路在不同的靶細(xì)胞中發(fā)揮著不同的作用。Hh以及它下游信號(hào)分子的變異與多種癌癥等疾病的發(fā)生有關(guān)。因此，研究Hh信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對(duì)于了解動(dòng)物體的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制以及某些疾病的發(fā)生都有著重要意義。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，Hh信號(hào)通路能夠調(diào)控動(dòng)物脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，至于它在不同物種中的調(diào)控作用是否一致尚有爭(zhēng)議。
　　作為一種重要的

2、經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，家蠶不僅是鱗翅目昆蟲(chóng)的典型模式生物，同時(shí)也是開(kāi)發(fā)新一代生物反應(yīng)器的重要材料。脂肪體是家蠶體內(nèi)重要的組織器官，它既是糖類、脂類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成和代謝中心，還具有貯存營(yíng)養(yǎng)、解毒以及為生命周期活動(dòng)提供各種生物合成的代謝產(chǎn)物等生理功能。家蠶脂肪體遍布其整個(gè)體腔，具有類似哺乳動(dòng)物肝臟和腎臟的功能。脂肪體內(nèi)貯存物質(zhì)豐富與否與幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育及變態(tài)、成蟲(chóng)產(chǎn)卵量和卵質(zhì)量好壞都有密切關(guān)系。因此，本文主要研究Hh信號(hào)通路對(duì)于家蠶脂肪細(xì)胞分化發(fā)育的

3、調(diào)控作用。
　　本研究所涉及到的基因包括:Ⅰ.Hedgehog信號(hào)通路的組成基因:分泌蛋白Hh、受體Ptch和Smo、下游轉(zhuǎn)錄因子Ci以及Fu、Cos2。Ⅱ.脂肪酸結(jié)合蛋白AP2，它主要在脂肪細(xì)胞中作為脂質(zhì)伴侶而表達(dá)，它的表達(dá)量能夠在一定程度上表明脂肪的含量。
　　本研究包括以下五部分內(nèi)容:
　　(1).克隆并鑒定家蠶Hh信號(hào)通路的組成基因(Hh、Ptch、Smo、Ci、Fu、 Cos2)以及脂肪標(biāo)記基因AP2。對(duì)Hh

4、進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，家蠶Hh蛋白與其它物種（如斑馬魚(yú)、果蠅、小鼠和人等）Hh蛋白的氨基酸序列均高度相似，證明了Hh蛋白是一種比較保守的蛋白質(zhì)。
　　(2).Hh信號(hào)通路在家蠶幼蟲(chóng)不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同組織中的表達(dá)情況分析。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Hh信號(hào)通路在家蠶幼蟲(chóng)不同生長(zhǎng)時(shí)期活性不同，其中胚胎期活性最高，隨著幼蟲(chóng)生長(zhǎng)其活性逐漸降低，這表明Hh信號(hào)通路主要在家蠶胚胎期起作用。同時(shí)，在家蠶不同組織的檢測(cè)表明，Hh信號(hào)通路在

5、新陳代謝旺盛的組織中活性較高，如絲腺、脂肪體和性腺等。此外，通過(guò)對(duì)家蠶幼蟲(chóng)三個(gè)不同時(shí)期（五齡第1天、熟蠶、蛹）脂肪體中Hh信號(hào)通路活性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路在家蠶脂肪體快速生長(zhǎng)或解離的時(shí)期如五齡初期、蛹期活性很高，而在其沒(méi)有明顯變化的時(shí)期如熟蠶期活性較低，說(shuō)明Hh信號(hào)通路在家蠶脂肪形成中起著重要作用。
　　(3).在BmN細(xì)胞系中進(jìn)行Hh基因的過(guò)表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)Hh基因?qū)υ撏废掠位蛞约爸緲?biāo)記基因AP2的調(diào)控。利用改良

6、后的piggyBac轉(zhuǎn)座載體將外源Hh基因插入BmN細(xì)胞基因組中，篩選鑒定后得到穩(wěn)定的Hh過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。同時(shí)，體外合成dsRNA轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞來(lái)抑制Hh基因的表達(dá)。對(duì)比Hh過(guò)表達(dá)和RNAi結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在Hh信號(hào)通路中，Smo、Ci、Fu為正調(diào)控因子，Ptch和Cos2為負(fù)調(diào)控因子，并且Hh信號(hào)通路抑制AP2基因的表達(dá)。
　　(4).藥物處理—體外實(shí)驗(yàn)。利用環(huán)杷明（Hh通路特異性拮抗劑）處理家蠶體外原代培養(yǎng)脂肪細(xì)胞。結(jié)果表明:環(huán)

7、杷明抑制家蠶體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞中Hh信號(hào)通路的表達(dá)，促進(jìn)AP2的表達(dá);觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明處理明顯加快脂肪細(xì)胞的分化。說(shuō)明在家蠶體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞中，Hh信號(hào)通路受到抑制會(huì)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。
　　(5).藥物處理—體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。四齡起家蠶幼蟲(chóng)每天添食一定量的環(huán)杷明，三天后取脂肪體進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路表達(dá)水平受到抑制。連續(xù)添食至五齡第1天，取幼蟲(chóng)脂肪體做石蠟切片觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明處理明顯促進(jìn)家蠶幼蟲(chóng)