小膠質(zhì)細胞對次聲損傷的反應變化及對原代培養(yǎng)神經(jīng)元的影響.pdf

1、次聲（infrasound）是由物體(物質(zhì))的機械性振動所產(chǎn)生，頻率為0．0001～20Hz的聲波，具有穿透性強、傳播距離遠和衰減慢等特點。廣泛存在于自然界和人工環(huán)境中，包括海潮、地震、海嘯、大型機械和火箭發(fā)射等。盡管人耳不能聽到次聲，但是實驗研究發(fā)現(xiàn)高強度次聲可以對人體和多種動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的損傷，包括下丘腦、皮層和皮層下廣泛區(qū)域等。
　　隨著現(xiàn)代工業(yè)和運輸業(yè)的發(fā)展，次聲在噪音污染中扮演了重要的角色。有研究表明：次聲損傷

2、CNS的機制之一就是引起炎癥反應，但是關于次聲引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的具體機制仍然知之甚少。MI作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細胞，在炎癥過程中發(fā)揮重要作用，因此對它的研究就顯得尤為重要。MI在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時會很快地向損害區(qū)域移動，一方面保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)，限制和清除外來微生物，吞噬和消除有害物質(zhì)和壞死的大腦碎片；另一方面MI可以產(chǎn)生多種細胞因子，并參與抗原呈遞過程，構成腦內(nèi)的免疫系統(tǒng)，參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的過程。它們或發(fā)揮保護性

3、作用，使疾病轉(zhuǎn)歸痊愈；或引起疾病的遷延，加重疾病的損傷使得疾病惡化。
　　我們實驗室前期的工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)次聲可以明顯活化腦內(nèi)的MI。有研究證明，活化的MI對神經(jīng)元來說是一把雙刃劍，既引起神經(jīng)元的損傷，也可對損傷的神經(jīng)元起到保護性作用。但是次聲作用后的小膠質(zhì)細胞具體會發(fā)生什么變化以及在次聲損傷過程中的確切作用仍不明了。我們通過利用16Hz130dB高強度次聲作用于體外培養(yǎng)的大鼠MI，并設計以下實驗對上述兩個問題進行了初步的探討。

4、>　　實驗一體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞對次聲的反應。實驗二次聲活化的小角質(zhì)細胞上清液對神經(jīng)元的影響。實驗三體外模擬次聲活化的小膠質(zhì)細胞分泌的TNF-α,IL-1β等對神經(jīng)元的損傷試驗以及TNF-α,IL-1β等細胞因子的中和性抗體的保護神經(jīng)元的作用。實驗四次聲作用后的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分泌幾種細胞因子的變化情況。實驗結果如下：
　　實驗一:體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞對次聲的反應。
　?。?）細胞改變：正常的MI胞體較小，胞漿少，圓而突

5、起少。次聲后即刻見MI胞體變大。次聲后4h阿米巴樣細胞增多，細胞分裂活躍。次聲12h后MI腫脹更明顯，胞漿內(nèi)空泡增多。次聲24h后MI胞漿更豐富，雙核細胞更多。
　　（2）細胞因子變化：在次聲作用30min后即刻MI上清液中的IL-10就開始升高，到12h達到高峰.。TNF-α和IL-1β的表達則是在次聲作用后4h即開始升高到12h升高至峰值，然后降低。在次聲作用1h后，MI培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α與IL-1β含量在24h內(nèi)呈持

6、續(xù)性升高,而兩者的分泌并不同步。IL-1β的升高在作用后即刻就明顯升高；而TNF-α一直到作用后12h才見明顯升高，明顯滯后于IL-1β的分泌。而保護性因子IL-10在4h和24h出現(xiàn)雙峰值，并且各觀察點數(shù)值與對照組相比均明顯升高。
　　實驗二:次聲活化的小角質(zhì)細胞上清液對神經(jīng)元的影響。
　　次聲作用30min和1h后不同時間點收集的MI上清對神經(jīng)元的影響：（a）MTT結果：次聲暴露30min后的MI在各時間點收集的上清液對

7、原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細胞不會產(chǎn)生損傷作用；次聲作用1h后的MI各時間點收集的上清液對原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細胞均會產(chǎn)生明顯的損傷作用。（b）TUNEL檢測凋亡結果：次聲暴露30min后各時間點收集的MI上清液對原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細胞不會產(chǎn)生促凋亡的作用；次聲暴露1h后各時間點收集的MI上清液對原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細胞均會產(chǎn)生明顯的促凋亡作用。且次聲作用1h后24h時間點收集的MI上清液引起神經(jīng)元的凋亡最明顯。
　　實驗三:體外模擬

8、次聲活化的小膠質(zhì)細胞分泌的TNF-α,IL-1β等對神經(jīng)元的損傷試驗以及TNF-α,IL-1β等細胞因子的中和性抗體的保護作用。
　?。?）次聲作用1h后的MI分泌的TNF-α,IL-1β等對神經(jīng)元的模擬損傷試驗以及TNF-α,IL-1β等細胞因子的中和性抗體的保護神經(jīng)元的作用。流式細胞儀檢測結果:次聲1h后，MI分泌的TNF-α,IL-1β模擬損傷神經(jīng)元細胞的凋亡率平均分別為443.2％和57±4.8％,而兩者共同作用引起的凋亡

9、率平均是67.5±6.4％；而5μg/ml的TNF-α,IL-1β等細胞因子的中和性抗體可以完全中和掉次聲后小膠質(zhì)細胞分泌的TNF-α,IL-1β的生物學活性，且應用5μg/ml的TNF-α,IL-1β等細胞因子的中和性抗體的濃度不會影響神經(jīng)元細胞的狀態(tài)。
　?。?）在次聲作用1h后24h時間點收集的MI上清液中分別加入TNF-α、IL-1β和TNF-α/IL-1β的中和性抗體后，一定量置換大鼠神經(jīng)元細胞培養(yǎng)液后48h后對神經(jīng)元的

10、影響：（a）流式細胞儀檢測凋亡結果:加入IL-1β和TNF-α/IL-1β中和性抗體的兩組與對照組（24h時間點組）和單純加入TNF-α中和性抗體組之間均有明顯的統(tǒng)計學差異；而單純加入TNF-α中和性抗體組與對照組無明顯統(tǒng)計學差異。
　　實驗四:次聲作用后的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分泌幾種細胞因子的變化情況。
　?。?）星形膠質(zhì)細胞改變：可見正常對照組星形膠質(zhì)細胞為形狀不規(guī)則，胞漿豐富且核漿比較少，胞體分支多，細胞核為橢圓形

11、，常偏于胞體一側的星形膠質(zhì)細胞。次聲作用1h后的星形膠質(zhì)細胞從顯微鏡下見變化在24h內(nèi)細胞變化不明顯。MI改變?nèi)鐚嶒炓唬伸o息狀態(tài)明顯地轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。
　　（2）星形膠質(zhì)細胞上清液中細胞因子的變化：在次聲作用1h后的星形膠質(zhì)細胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-10等細胞因子均可見在24h后才輕微升高。而MI上清液中多種細胞因子在次聲后4h內(nèi)就可見明顯的升高。
　　本實驗結論如下：
　?。?）結合以前工作基礎，進一

12、步證實暴露于16Hz130dB次聲后，大鼠小膠質(zhì)細胞可明顯從靜息轉(zhuǎn)變成活化狀態(tài)，并且這種反應要早于星形膠質(zhì)細胞。因此，小膠質(zhì)細胞可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)對次聲反應最早的細胞。
　?。?）16Hz130dB次聲30min活化的小膠質(zhì)細胞，其分泌的細胞因子不會對對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用；16Hz130dB次聲1h活化的小膠質(zhì)細胞在4h，12h和24h時間點的上清液均會對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用，主要是引起神經(jīng)元的凋亡，其中24h時間點產(chǎn)生的凋亡作用