LeukameninE對原代培養(yǎng)大鼠腦星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用的研究.pdf

1、毒理學(xué)是研究化學(xué)物質(zhì)對生物體的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度、發(fā)生頻率和毒性作用機制，也是對毒性作用進(jìn)行定性和定量評價的一門學(xué)科。體外細(xì)胞實驗等生物技術(shù)由于其高通量、高精度、快速以及平行性的特點，已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的一項先進(jìn)實用的技術(shù)，具有很高的應(yīng)用價值。毒理學(xué)的研究必定要深入到細(xì)胞及分子水平。中藥（尤其是其復(fù)方制劑）成分復(fù)雜，應(yīng)用傳統(tǒng)方法評價中藥的遺傳毒性十分困難，而借助現(xiàn)代細(xì)胞學(xué)技術(shù)，從細(xì)胞水平上對藥物在體外進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高效的安全性

2、評價，使得我們能從微觀角度更好地了解中藥遺傳毒性的作用靶點及其作用機制。
　　 星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AS），作為神經(jīng)系統(tǒng)中起營養(yǎng)、支持及保護(hù)神經(jīng)元作用的一類細(xì)胞，由于其敏感性高，更易受到毒性物質(zhì)的損傷。許多證據(jù)表明，星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在許多神經(jīng)退行性疾病中有十分重要的作用。迄今為止，有關(guān)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毒性的研究尚未見到報道。
　　 香茶菜屬植物幾乎遍布我國各地，并且種類繁多，約有30種原植物在民間作藥用

3、，具有清熱解毒、活血化淤、抗菌消炎、抗腫瘤、治療肝炎等各種功效。在藥用香茶菜中，二萜類化合物含量豐富，是其主要的活性成分。其中C-20-未氧化-對映-貝殼杉烯型二萜化合物是生物活性最強的一類，Leukamenin E即為其中的一種。
　　 本論文進(jìn)行了Wistar 大鼠星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)，以對映-貝殼杉烯二萜化合物L(fēng)eukamenin E為受試藥物，通過SRB檢測、臺盼藍(lán)排染、彗星電泳、吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙染

4、、細(xì)胞形態(tài)的觀察及核染色質(zhì)形態(tài)觀察等方法，初步研究了該化合物對星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長的影響以及其作用機制，以期為Leukamenin E的進(jìn)一步合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果如下：
　　 (1)成功培養(yǎng)了AS并對其進(jìn)行了純化。實驗通過組織消化、限制性培養(yǎng)以及搖床震蕩等方法，得到了純度高、狀態(tài)良好的AS培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)的AS在接種后2-3d完成貼壁，9-12d即可鋪滿培養(yǎng)瓶底。初級培養(yǎng)物含有包括小膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少量神經(jīng)元在內(nèi)的多

5、種細(xì)胞，通過限制性培養(yǎng)降低這些細(xì)胞的含量，而神經(jīng)元逐漸退化，最終死亡；搖床震蕩利用細(xì)胞差速貼壁的原理，除去雜細(xì)胞，最終得到純度較高的AS培養(yǎng)物。
　　 (2)SRB法及臺盼藍(lán)排染法檢測細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，Leukamenin E對AS有很強的細(xì)胞毒性，在0.625μM以及1.25μM的低濃度作用下對細(xì)胞具有顯著的生長抑制效應(yīng)，而在5μM以及10μM的高濃度作用時能致細(xì)胞死亡。生長抑制效應(yīng)和致死效應(yīng)都具有顯著的時間、劑量依賴性。

6、r>　　 (3)倒置顯微鏡形態(tài)觀察及吉姆薩染色顯示，Leukamenin E作用可以引起細(xì)胞形態(tài)的顯著改變，并且有明顯的時間、劑量效應(yīng)。吉姆薩染色實驗中，隨化合物濃度的增加（1.25μM、2.5μM），細(xì)胞膜表面微絨毛不清晰甚至消失，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，在高濃度藥物（5μM）作用下，觀察到核碎裂。
　　 (4)彗星電泳實驗結(jié)果顯示，化合物L(fēng)eukamenin E可以引起AS DNA的損傷，并具有時間-劑量效應(yīng)。隨著化合物作用濃度