吸水鏈霉菌10-22中硫肽類抗生素cyclothiazomycin生物合成機制的研究.pdf

1、硫肽類抗生素是一類由微生物生產(chǎn)的重要天然產(chǎn)物，對很多高抗藥病原菌都有很強的抑制作用。它們共享一些典型的結(jié)構(gòu)特征，包括含多個半胱氨酸衍生的兩個氨基酸殘基間的異源環(huán)（包括噻唑和噻唑啉）、分子結(jié)構(gòu)中心位置的6元含氮雜環(huán)（吡啶或者脫水哌啶環(huán)）。多年來，這些不同尋常的氨基酸衍生結(jié)構(gòu)一直吸引著有機化學家們在實驗室中嘗試通過有機合成的手段來實現(xiàn)，但是生物體本身究竟是如何合成這類產(chǎn)物，卻很少有實驗數(shù)據(jù)來描述其生物合成過程。
　　 環(huán)噻唑霉素(

2、cyclothiazomycin，CLT)是一種新近分離且已經(jīng)有立體化學結(jié)構(gòu)鑒定報道的硫肽類抗生素，有腎素抑制劑的應用潛力。它是一種比較特別的硫肽類抗生素，除了具備硫肽類的共有特征外，自身有多處結(jié)構(gòu)較為罕見，包括非2，3-位噻唑取代的中心吡啶環(huán)，噻唑啉和噻唑的數(shù)目平分秋色以及一個叔碳上的硫醚鍵。
　　 本實驗室保存的吸水鏈霉菌應城變種10-22由我國科學家分離得到，能夠產(chǎn)生三種農(nóng)用抗生素的，其中一種多肽類抗生素5102-11的生

3、物合成機制多年來困擾著我們。NRPS思路的失敗令我們轉(zhuǎn)而考慮核糖體合成的途徑。基于此猜想，利用一對基于核糖體合成途徑中特有的環(huán)化脫水酶的保守序列設計的兼并引物，我們從10-22的基因組中克隆到了一個0.7kb的目標片段?；谠撈卧O計的特異引物在10-22基因組文庫中釣到了兩個陽性柯絲質(zhì)粒(cosmid)。限制性內(nèi)切酶消化后的片段序列測序結(jié)果證實，其中包含有一小段DNA序列，編碼60aa的一個多肽，其中C端18aa的序列和CLT的結(jié)構(gòu)氨

4、基酸序列順序完全一致。后續(xù)的生測實驗、QTOF分子量檢測分析以及二級質(zhì)譜碎片分析都證明10-22所產(chǎn)的多肽類抗生素就是CLT。
　　 柯絲質(zhì)粒測序結(jié)果顯示整個35kb左右的插入片段中包含了27個ORF。根據(jù)ORF的分布情況，我們構(gòu)建了多個異源表達載體，首次在鏈霉菌的模式菌株變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans1326中實現(xiàn)硫肽類抗生素的異源表達，并通過不同ORF的組合定位出了一個完整的環(huán)噻唑霉素合成基因簇。這是

5、一個包含了15個ORFs、長度為22.7kb的核苷酸序列，生物信息學分析表明其中唯一一個結(jié)構(gòu)基因cltA編碼產(chǎn)生環(huán)噻唑霉素前體，前體多肽再經(jīng)由基因簇中的其他蛋白進行翻譯后修飾，最終成熟并釋放至胞外。
　　 我們推測整個過程中有9個蛋白參與，其中6個基因，cltBCDEFG，圍繞在前體肽基因cltA周圍可能成一個大的操縱子，他們負責環(huán)噻唑霉素主體結(jié)構(gòu)的合成，包括：CltB負責對半胱氨酸(Cys)殘基和其臨近的殘基之間脫水環(huán)化形成分

6、子間的異源噻唑啉；CltC則選擇性識別成雙的噻唑啉結(jié)構(gòu)而只催化脫氫N端的一個從而形成CLT分子中噻唑啉和噻唑啉平分秋色的局面；2，3位非噻唑環(huán)取代的中心吡啶區(qū)域的形成則可能包括環(huán)化脫水、前導鏈切除和脫氨基三個過程，CltD由于擁有環(huán)化脫水酶和肽酶兩個結(jié)構(gòu)域，被認為是負責催化吡啶形成的主力軍，并由此推測吡啶形成和前導肽的切除是同時進行的；CltG則很可能是一個脫氨基酶；脫水氨基酸的形成和lantibiotic的情形類似，由兩個脫水酶Clt

7、E和CltF負責催化形成的。還有兩個基因cltM/N，我們認為其編碼的產(chǎn)物負責環(huán)噻唑霉素最后成環(huán)的一個叔碳硫醚鍵的形成；該硫肽分子完成所有翻譯后修飾后，由轉(zhuǎn)運蛋白CltO識別結(jié)合成熟產(chǎn)物并將之轉(zhuǎn)運至胞外。
　　 就在2009年初，3個不同的硫肽類抗生素的合成基因簇序列幾乎同時在三個不同的實驗室得到突破，分析結(jié)果相當一致，認為硫肽類抗生素就是一類基因組編碼、核糖體合成后經(jīng)由一系列的后修飾成熟釋放的一類抑菌多肽。本研究為這個結(jié)論提供