腫瘤壞死因子α在骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡及明膠酶表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、目的：分析膝骨關(guān)節(jié)炎病人的病變軟骨細(xì)胞調(diào)亡的存在，及在TNFα刺激下細(xì)胞調(diào)亡及明膠酶（基質(zhì)金屬蛋白酶-MMP-2，MMP-9）活性的變化，著重探討決定軟骨細(xì)胞凋亡的信號通路，比較同等條件刺激下滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞凋亡命運(yùn)的區(qū)別。
　　 方法：從骨關(guān)節(jié)炎（OA）病人行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)（TKA）中切除的軟骨及滑膜組織中，將切削、消化后的軟骨及滑膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，取原代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。人重組TNFα單獨刺激及和其通路上不同蛋白的抑制因子聯(lián)

2、合刺激，收集細(xì)胞后，行Annexin V-FITC及PI雙染后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測凋亡，同時裂解細(xì)胞、提取蛋白行Western blot檢測caspase-3和PARP的激活情況；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，行明膠酶譜分析以檢測MMP-2和MMP-9的活性變化。
　　 結(jié)果： OA軟骨細(xì)胞表達(dá)激活形式的caspase-3和PARP，提示其具有調(diào)亡背景。170ng/m人重組TNFα單獨刺激，不能增加軟骨細(xì)胞調(diào)亡。抑制P13K（10uMLY29

3、4002）或NF-kB（1nM CAPE）后，聯(lián)合TNFα刺激可增加軟骨細(xì)胞調(diào)亡，調(diào)亡抑制因子c-FLIP表達(dá)下調(diào)。抑制MEK1/2（10uM U0126）或mTOR（10nMRapamycin），聯(lián)合TNFα刺激不能增加軟骨細(xì)胞調(diào)亡。相反地，同樣刺激條件下，即NF-kB抑制劑（1nM CAPE）聯(lián)合170ng/mlTNFα刺激后，滑膜細(xì)胞的調(diào)亡較對照組及單藥刺激組反而減少。170ng/ml TNFα可顯著性地增加軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)的酶

4、原MMP-9、激活MMP-9、酶原MMP-2和激活MMP-2的表達(dá)。抑制NF-kB（1nM CAPE）能顯著性抑制TNFα誘導(dǎo)的酶原MMP-9的增加。細(xì)胞培養(yǎng)上清中激活MMP-9與總MMP-9的比值隨時間而增大，鈣離子可延緩但不能阻止該進(jìn)程。相比于200umol/L和10umol/L的鈣離子濃度，關(guān)節(jié)腔內(nèi)生理濃度2.5mmol/L可發(fā)揮最大作用。提示OA軟骨細(xì)胞分泌的酶原MMP-9存在自激活現(xiàn)象，關(guān)節(jié)腔內(nèi)鈣離子對MMP-9的基質(zhì)降解可能

5、起到暫時保護(hù)的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.P13K-NF-κB通路，而不是P13K-mTOR或MEK1/2通路能保護(hù)軟骨細(xì)胞免受TNFα引起的調(diào)亡，c-FLIP發(fā)揮重要作用。
　　 2.同等濃度TNFα和同等程度NF-κB抑制下，滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞抵抗調(diào)亡的特性不一樣。
　　 總之，阻斷或抑制NF-κB，可能在抑制滑膜細(xì)胞調(diào)亡、抑制軟骨分泌MMP9方面有利于延緩疾病進(jìn)展，但需高度警惕軟骨細(xì)胞調(diào)亡，注意