腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子在骨關(guān)節(jié)炎形成機(jī)制中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病之一，在老年人中發(fā)病率較高。主要表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)的慢性、退行性改變。在全世界范圍內(nèi)，OA的患病率居首位。在我國(guó)，隨著人口老齡化日益加重，OA的發(fā)病率逐年上升。OA是力學(xué)和生物學(xué)因素作用下導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨降解與合成耦聯(lián)失平衡所致。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)于OA病因的研究側(cè)重于生物力學(xué)的改變，因?yàn)閱紊锪W(xué)因素不能完全解釋OA的發(fā)病機(jī)理，近幾年側(cè)重點(diǎn)有所改變，

2、著重于酶學(xué)、炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞凋亡等。
　　現(xiàn)有的研究表明，OA的主要病理機(jī)制是在炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)下，致病因素促進(jìn)各種蛋白酶在關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中的表達(dá)增高，降解關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中膠原纖維網(wǎng)和蛋白多糖，促使關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。有很多炎性細(xì)胞因子及趨化因子等參與了蛋白酶的調(diào)控。其中最重要的是IL-1β和TNF-α，它們不僅在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起主導(dǎo)作用，在OA中它們更主要的功能是上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinas

3、es，MMPs)的表達(dá)，增加MMPs的活性。既然IL-1β和TNF-α在OA中扮演著重要的角色，能否通過(guò)抑制這兩種因子來(lái)控制OA?但是臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制IL-1β和TNF-α并沒(méi)有在OA病人中出現(xiàn)理想的效果。我們認(rèn)為這可能源于OA中存在更多的各種致病因子及它們之間復(fù)雜的相互作用，當(dāng)然還包括許多我們未知的因子。這些細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào)，相互作用，刺激MMPs的合成與分泌，最后促進(jìn)軟骨組織的降解。
　　腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(t

4、umor necrosis factor-like weakinducer of apoptosis，TWEAK)是一種屬TNF配體超家族成員(tumor necrosisfactor superfamily，TNFSF)的細(xì)胞因子，能微弱誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而由此命名。更多研究發(fā)現(xiàn)，TWEAK可在多種細(xì)胞上表達(dá)，是一種多功能的細(xì)胞因子，它不僅可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且具有促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子分泌及細(xì)胞增生等生物學(xué)效應(yīng)，還能特異性抑制軟骨形

5、成，從而阻礙軟骨的內(nèi)源性修復(fù)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)因子14(fibroblast growth factor inducible14，F(xiàn)n14)是一種TWEAK受體，廣泛表達(dá)于多種組織，可通過(guò)連接不同的含有TNF受體相關(guān)因子(TNFreceptor-associated factor，TRAF)結(jié)構(gòu)域的受體蛋白或胞漿蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。證據(jù)表明，TWEAK是類似于IL-1β和TNF-α的多功能細(xì)胞因子，它是否也協(xié)同參

6、與了關(guān)節(jié)軟骨降解的演變過(guò)程？TWEAK及其受體Fn14是否也在OA中扮演了一定的角色？
　　本研究擬通過(guò)大鼠OA模型檢測(cè)TWEAK及其受體Fn14 mRNA及蛋白在病變關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織中的表達(dá)情況，及TWEAK對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的影響情況，擬對(duì)TWEAK及其受體Fn14在OA發(fā)病機(jī)制中的作用有初步的認(rèn)識(shí)，為探索OA治療新方案提供理論依據(jù)。
　　第一部分大鼠骨關(guān)節(jié)

7、炎模型的建立及評(píng)價(jià)
　　目的：制作大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，并進(jìn)行大體及光鏡下的觀察及組織學(xué)評(píng)價(jià)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　材料與方法：用前交叉韌帶切斷術(shù)(anterior cruciate ligamenttransaction，ACLT)制作大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，假手術(shù)組及正常組作為對(duì)照。在術(shù)后1周、2周及4周觀察膝關(guān)節(jié)退變的大體改變，光鏡下觀察軟骨的組織學(xué)改變，并用Mankin評(píng)分系統(tǒng)評(píng)分。
　　結(jié)果：不同時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組膝關(guān)

8、節(jié)大體及光鏡下均觀察到OA特征性的退行性改變，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重，符合整個(gè)OA的病理發(fā)展過(guò)程，且代表了OA的早中期，有利于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)論：我們用ACLT制作的大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，造模效果確切穩(wěn)定，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性打好了基礎(chǔ)。
　　第二部分 TWEAK及其受體Fn14在大鼠骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中的表達(dá)
　　目的：檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型中軟骨及滑膜組織TWEAK及其受體Fn14mRNA及蛋白的表達(dá)

9、情況，及關(guān)節(jié)液中TWEAK的濃度變化。
　　材料與方法：制作大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，用假于術(shù)組及正常組作為對(duì)照。在術(shù)后第1周、第2周及第4周后收集軟骨組織、滑膜組織及關(guān)節(jié)液。實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)TWEAK及其受體Fn14 mRNA的表達(dá);蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)TWEAK及其受體Fn14蛋白的表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay

10、，ELISA)檢測(cè)關(guān)節(jié)液中TWEAK的濃度變化。
　　結(jié)果：OA模型組滑膜組織中TWEAK及其受體Fn14 mRNA和蛋白的表達(dá)在造模后第2及第4周均高于假手術(shù)組及正常對(duì)照組;OA模型組軟骨組織中TWEAK及其受體Fn14 mRNA和蛋白的表達(dá)在造模后第2周高于假手術(shù)組及正常對(duì)照組;OA模型組關(guān)節(jié)液中TWEAK的濃度在造模后第1周、第2周及第3周均高于假手術(shù)組及正常對(duì)照組。
　　結(jié)論：大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型中，關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織

11、中TWEAK及其受體Fn14mRNA及蛋白的表達(dá)在病程的部分時(shí)段明顯升高，且關(guān)節(jié)液中TWEAK的濃度也持續(xù)增高，它們與OA的病理過(guò)程有著緊密的關(guān)聯(lián)。
　　第三部分 TWEAK對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的影響
　　目的：檢測(cè)TWEAK對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的影響
　　材料與方法：使用Wistar大鼠，取正常關(guān)節(jié)

12、軟骨及滑膜組織，培養(yǎng)軟骨細(xì)胞及成纖維樣滑膜細(xì)胞并鑒定，使用TWEAK刺激軟骨細(xì)胞及成纖維樣滑膜細(xì)胞，收集刺激后24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后的上清液，ELISA法測(cè)定上清液中的下列成份:①基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13）;②炎性細(xì)胞因子(IL一1β、IL-6、TNF-α);③趨化因子(RANTES、MCP-1、MIP-2、IL-8)。
　　結(jié)果：TWEAK刺激后軟骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金

13、屬蛋白酶（MMP-1、MMP-3、MMP-9）、炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和趨化因子(RANTES、MCP-1、IL8)顯著增加;但MIP-2的產(chǎn)生在兩種細(xì)胞中均顯著減少;MMP-13僅在軟骨細(xì)胞中的產(chǎn)生顯著增加，而在成纖維樣滑膜細(xì)胞中無(wú)變化。且增加的程度大多與刺激的時(shí)間呈正相關(guān)，僅MIP-2呈負(fù)相關(guān);但軟骨細(xì)胞在TWEAK的刺激下，產(chǎn)生MCP-1、IL-8、MMP-3和MMP13的量沒(méi)有隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;成纖