三仁湯對脾胃濕熱證大鼠Th1-Th2細胞因子、胃粘膜上皮細胞凋亡蛋白Fas、Bcl-2的影響.pdf

1、目的：
　　 脾胃濕熱證是脾胃實證中的一個常見證型，是中醫(yī)“證”的研究的重要內(nèi)容。Th1/Th2細胞平衡、胃粘膜上皮細胞的凋亡與增殖在一定程度上體現(xiàn)了機體內(nèi)陰陽的相互對立制約和相互作用，這與脾胃濕熱證的陰陽合邪、正邪相爭、陰陽的動態(tài)平衡存在著一定的聯(lián)系。本實驗根據(jù)脾胃濕熱證的發(fā)病特點，通過“內(nèi)濕熱+外濕熱+生物致病因子”復(fù)合因素構(gòu)建脾胃濕熱證動物模型，以該模型為基礎(chǔ)，觀察脾胃濕熱證大鼠模型的體重、肛溫等形態(tài)學(xué)改變，用ELISA法

2、檢測血清Th1/Th2細胞因子IFN-γ/IL-4的表達水平，取大鼠胃、十二指腸和大腸組織行病理切片，用SABC法行免疫組化染色檢測胃粘膜上皮細胞凋亡蛋白Fas、Bcl-2的平均光密度，探討脾胃濕熱證與細胞免疫平衡之間的關(guān)系及三仁湯的療效，有助于加深對脾胃濕熱證生物學(xué)基礎(chǔ)及發(fā)病機制的認(rèn)識，提高脾胃濕熱證的整體研究水平。
　　 方法：
　　 將50只雄性SPF級SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機分為5組:正常對照組、脾胃濕熱模

3、型組、三仁湯（低、中、高劑量）組。以高脂高糖飲食+人工熱氣候模擬艙（環(huán)境設(shè)置為:干球溫度33±0.5℃，相對濕度65±5％，每日上午9時至11時）+生物致病因子（109CFU/ml鼠傷寒沙門氏菌）造成脾胃濕熱證模型。模型復(fù)制完畢后三仁湯高、中、低劑量組大鼠按2ml/200g灌服相應(yīng)濃度的藥物，正常對照組和脾胃濕熱模型組灌服等容積生理鹽水。給藥每天一次，持續(xù)7天。實驗期間每天記錄飲水量和攝食量，分別于造模前、造模第10天、第18天和給藥后

4、測定大鼠體重，于造模前、造模后及給藥后測定肛溫。實驗結(jié)束后腹主動脈采血，離心后取血清，運用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定大鼠血清IFN-γ和IL-4水平。取胃、十二指腸、大腸組織行光鏡下病理組織學(xué)檢查。按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書運用SABC法檢測大鼠胃粘膜上皮細胞凋亡蛋白Fas、Bcl-2的表達變化。資料數(shù)據(jù)采用spss13.0軟件進行重復(fù)測量(Repeatedmeasured)方差分析和One-wayANOVA分析，P＜0.05表

5、示具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠一般狀態(tài)和攝食量、飲水量的變化
　　 正常對照組大鼠精神狀態(tài)好，皮毛有光澤，反應(yīng)靈敏，飲水和攝食量均衡。和正常對照組比較，脾胃濕熱模型組和三仁湯高、中、低劑量組大鼠在造模過程中逐漸出現(xiàn)精神萎靡，嗜臥懶動，皮毛無光澤，反應(yīng)遲鈍，大便稀或溏泄，肛周污穢，攝食量和飲水量有減少的趨勢，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異(P＜0.05)。給藥后與模型組大鼠比較，給藥組大鼠一般狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，

6、三仁湯高(P=0.001，P＜0.01)、中(P=0.024，P＜0.05)、低劑量組(P=0.022，P＜0.05)大鼠攝食量明顯增加，飲水量有增加趨勢(P＞0.05)。
　　 2.給藥組對脾胃濕熱證大鼠體重和肛溫的影響
　　 正常對照組大鼠體重呈進行性增長，肛溫?zé)o明顯改變。與正常對照組比較，造模后，脾胃濕熱模型組和三仁湯高、中、低劑量組大鼠體重增長緩慢，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異(P=0.152，P＞0.05)，各組肛溫均

7、顯著升高(P＜0.001)。給藥后，與模型組比較，三仁湯高、中、低劑量組大鼠體重增長較模型組均有加快的趨勢，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異（P＞0.05）;給藥組大鼠肛溫均顯著降低(P＜0.05)。
　　 3.給藥組對脾胃濕熱證大鼠血清IFN-γ表達水平的影響
　　 與正常對照組比較，脾胃濕熱證模型組和三仁湯高、中、低劑量組IFN-γ表達水平明顯升高（P＜0.001），以模型組為最高。與脾胃濕熱模型組比較，三仁湯低、中劑量組能明顯

8、降低IFN-γ表達水平(P＜0.001)，三仁湯高劑量組有降低IFN-γ水平的趨勢，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4.給藥組對脾胃濕熱證大鼠血清IL-4表達水平的影響
　　 與正常對照組比較，脾胃濕熱證模型組和三仁湯高、中、低劑量組IL-4水平明顯升高(P＜0.001)，以脾胃濕熱模型組為最高。與脾胃濕熱模型組比較，三仁湯高、中、低劑量組均能明顯降低IL-4表達水平(P＜0.001)，以低劑量組效果最好。

9、
　　 5.給藥組對脾胃濕熱證大鼠血清IFN-γ/IL-4比值的影響
　　 與正常對照組比較，三仁湯高劑量組IFN-γ/IL-4比值明顯升高(P=0.001，P＜0.01)，模型組IFN-γ/IL-4比值有升高的趨勢，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異(P＞0.05)。與脾胃濕熱模型組比較，三仁湯高劑量組IFN-γ/IL-4比值明顯升高(P=0.028，P＜0.05)，低劑量組有降低IFN-γ/IL-4比值的趨勢，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異

10、(P=0.144，P＞0.05)
　　 6.給藥組對脾胃濕熱證大鼠胃、十二指腸、大腸粘膜組織的影響（圖1）
　　 HE染色后，光鏡下觀察，正常組大鼠胃粘膜層結(jié)構(gòu)完整，十二指腸、大腸絨毛排列緊密，柱狀上皮細胞排列整齊。模型組大鼠胃粘膜組織充血水腫，固有層和粘膜下層可見大量中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤;十二指腸和大腸可見粘膜組織充血水腫，上皮脫落、壞死，間質(zhì)可見大量炎細胞浸潤。三仁湯高、中、低劑量組與模型組比較，大鼠胃粘膜結(jié)

11、構(gòu)清楚，十二指腸絨毛上皮較完整，大腸上皮細胞排列整齊，固有層可見散在的炎細胞浸潤。
　　 7.給藥組對脾胃濕熱證大鼠胃粘膜Fas蛋白表達的影響
　　 圖像分析結(jié)果顯示:正常對照組大鼠胃粘膜組織中Fas蛋白的表達主要在胃腺區(qū)，散在分布，細胞著色較深，呈中等陽性表達，胞漿呈棕黃染色(圖2-A)。與正常對照組比較，脾胃濕熱模型組中Fas蛋白表達減弱，細胞胞漿棕黃染色較淺，呈弱陽性表達（圖2-B），F(xiàn)as蛋白陽性細胞OD值顯著下

12、降(P=0.005，P＜0.01)。與模型組比較，三仁湯高、中、低劑量組Fas蛋白OD值均顯著升高(P＜0.001)(圖2-C～F)，呈中等陽性表達。
　　 8.給藥組對脾胃濕熱證大鼠胃粘膜Bcl-2蛋白表達的影響
　　 圖像分析結(jié)果顯示:正常對照組大鼠胃粘膜組織中Bcl-2蛋白的表達主要在胃腺區(qū)，散在分布，細胞著色較淺，呈弱陽性表達，胞漿呈淡棕黃染色（圖3-A）。與正常組比較，脾胃濕熱模型組中Bcl-2蛋白表達增強，細

13、胞質(zhì)著色深，呈強陽性（圖3-B），OD值顯著升高(P=0.016，P＜0.05)。與模型組比較，三仁湯低、中、高劑量組Bcl-2蛋白呈弱至中等陽性表達，OD值顯著降低(P=0.043，P＜0.05)（圖3-C～F），以低劑量組為最低。
　　 結(jié)論：
　　 1.“內(nèi)濕熱+外濕熱+生物致病因子”可成功復(fù)制脾胃濕熱證模型，模型大鼠可出現(xiàn)與脾胃濕熱證的臨床常見類似證候。
　　 2.脾胃濕熱證模型組大鼠血清Th1、Th2細

14、胞因子IFN-γ、IL-4表達水平明顯升高，提示脾胃濕熱證處于正邪抗?fàn)幍膭×业牟±頎顟B(tài)，存在免疫平衡失調(diào)，細胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)紊亂，有向Th1反應(yīng)漂移的趨勢。
　　 3.脾胃濕熱證模型組大鼠胃、十二指腸、大腸組織病理提示大量炎性細胞存在，表明脾胃濕熱證臨床所表現(xiàn)的癥狀有其形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 4.脾胃濕熱證動物模型胃粘膜上皮組織Fas蛋白表達下調(diào)，Bcl-2蛋白表達上調(diào)，存在細胞增殖與凋亡的失衡。
　　 5.三仁湯能