博萊霉素大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能變化與肺纖維化相關(guān)性研究.pdf

1、目的：EC作為血管基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，其重要的生理功能就是發(fā)揮其屏障功能，調(diào)節(jié)血管內(nèi)外的物質(zhì)交換，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使得鄰近或遠端的組織器官免受損害。細胞外基質(zhì)與EC粘附形成完整的內(nèi)皮屏障。在PF的發(fā)病過程中，起始階段的肺泡炎和纖維化形成階段均有血管通透性增高、EC間連接持續(xù)開放。這種內(nèi)皮屏障功能的異常為大分子物質(zhì)跨內(nèi)皮交換提供了旁路途徑，對肺損傷時炎癥細胞進入肺泡、肺間質(zhì)及激活Fb增殖具有重要意義。EC連接蛋白與肌動蛋白相連，與細胞

2、骨架一起受細胞內(nèi)[Ca2+]I的影響。本實驗通過電鏡、細胞培養(yǎng)、免疫組化、激光共聚焦掃描技術(shù)，觀察肺炎及PF大鼠PMVEC形態(tài)學改變，比較PF及正常大鼠PMVEC內(nèi)[Ca2+]I差異，并分析其負反饋調(diào)節(jié)因素—中電導鈣激活鉀通道蛋白質(zhì)1（Kca3.1）的表達特點，探討博萊霉素損傷時大鼠肺PMVEC屏障功能變化和機制以及PMVEC在PF發(fā)生中的地位和作用。 方法： SD大鼠20 只，體重150±20 g，雌雄不拘（第四軍醫(yī)大

3、學實驗動物中心）。隨機分為對照組和博萊霉素組(BLM組)，每組各10 只。博萊霉素A5（天津太河制藥，8mg/支，批號041103）用生理鹽水稀釋成4 g/L，按5 mg/kg體重氣管內(nèi)滴入0.15~0.2 ml制作PF模型，對照組氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水。兩組分別行PMVEC原代培養(yǎng)，以100 μL Fluo-3 /AM熒光指示劑（美國MolecularProbe公司）負載，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)[Ca2+]I熒光強度，應用免疫

4、細胞化學法及免疫熒光法分別測定Kca3.1 在EC的表達。透射電鏡觀察肺炎、BLM組及對照組PMVEC形態(tài)（電鏡標本由第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院放射科殷茜博士提供）。 結(jié)果： 1. 肺微血管內(nèi)皮細胞透射電鏡觀察 ① EC 緊密連接：對照組EC 管腔面光滑，沒有鑭顆粒附著，緊密連接未見開放。肺炎7 d 組EC 腔面有少量絮狀鑭顆粒，緊密連接開放，EC 呈增生狀態(tài)。肺炎14 d 組恢復光滑表面，未見鑭顆粒附著，EC 恢復正

5、常狀態(tài)，EC 周圍有少量膠原沉積。BLM 各組緊密連接持續(xù)開放，EC 腔面可見絮狀、線狀鑭顆粒及血小板附著。EC 表面不光整，可見指狀突起，EC 呈增生狀態(tài)，以7d 、14 d、21 d 組明顯。 ② EC 吞飲小泡：肺炎7 d 組EC 內(nèi)吞飲小泡明顯減少，而BLM 各組吞飲小泡均較豐富，特別是BLM 7 d 組，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量吞飲小泡，且體積增大。EC 旁可見較多膠原沉積，局部EC 與Fb 直接接觸。 2. 肺微血管內(nèi)

6、皮細胞內(nèi)游離Ca2+主要位于細胞漿。內(nèi)皮細胞[Ca2+]iBLM組（166.56±24.17）明顯高于對照組（95.79±13.51，p<0.01)，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義3. 肺微血管內(nèi)皮細胞Kca3.1 主要表達在細胞膜上。間接免疫熒光法BLM 組Kca3.1（679.29±206.98）明顯低于對照組（958.75±188.84，p<0.01)；免疫細胞化學法BLM 組Kca3.1 （ 169.08±14.81 ）明顯低于對照

7、組（189.78±13.73，p<0.01)，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1. 血管通透性增高、EC粘附性增加及EC轉(zhuǎn)運功能增強提示BLM組PMVEC的血管屏障功能發(fā)生異常，是炎癥細胞及血管活性物質(zhì)進入組織間的重要因素之一。 2. EC內(nèi)鈣過載是PMVEC屏障功能異常的重要原因，EC[Ca2+]I過載與EC表型轉(zhuǎn)換及EC功能變化密切相關(guān)。 3. PMVEC 細胞膜中電導鈣激活鉀通道蛋白質(zhì)1 活性