種鴨生殖系統(tǒng)新城疫病毒檢測及鴨新城疫病毒垂直感染動物試驗.pdf

1、鴨新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性、敗血性傳染病，該病可造成鴨的大量死亡，對養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴重。加強對該病的診斷方法和傳播方式的研究對預防和控制鴨新城疫的發(fā)生，保護和促進養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。本研究建立了兩種新城疫病毒的檢測方法，即鴨源新城疫病毒RT-PCR診斷方法和間接免疫熒光染色方法，并應用這兩種方法對人工感染種鴨生殖系統(tǒng)新城疫病毒進行了檢測，同時進行了鴨新城疫病毒垂直

2、感染動物試驗。
　　 本研究內容包括四部分：
　　 一、鴨源新城疫病毒RT-PCR診斷方法的建立與應用根據GenBank中新城疫 F基因序列設計、合成了1對引物擴增相對保守的727 bp的目的片段，建立了鴨源新城疫病毒病的RT-PCR診斷方法。該方法能從鴨源新城疫病毒SDFCH株擴增到727bp的特異性片段，而鴨瘟病毒、H9N2亞型流感病毒、鴨肝炎病毒擴增結果為陰性，敏感性試驗最低檢出量的cDNA濃度為3pg/μL。表明

3、所建立的RT-PCR方法特異性強、敏感性高。應用該方法對山東不同地區(qū)20株疑似鴨新城疫病毒分離株進行檢測，結果15份為陽性；對150份疑似新城疫病鴨的感染病變組織進行檢測，結果125例為陽性。
　　 二、鴨源新城疫病毒間接免疫熒光染色檢測方法的建立以抗新城疫病毒F蛋白的單克隆抗體為一抗，FITC-羊抗小鼠IgG為二抗，同時優(yōu)化固定液、黏片劑、洗滌液、抗體稀釋度及孵育時間、封片劑等試驗條件并進行標本自發(fā)熒光對照、熒光抗體對照、吸收

4、試驗、替代試驗等特異性試驗，建立了間接免疫熒光染色方法。結果顯示，感染NDV發(fā)病死亡鴨的輸卵管不同部位、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、胰腺、腦、心臟等組織切片IFA檢測發(fā)出明亮的黃綠色熒光，呈陽性。正常健康對照組種鴨鴨臟器組織切片IFA檢測未發(fā)出黃綠色熒光，呈陰性。對鴨瘟病毒、禽流感病毒、鴨疫里默氏桿菌、Ⅰ型鴨肝炎病毒感染致死鴨的病變組織檢測均無黃綠色熒光，呈陰性。結果表明建立的間接免疫熒光染色檢測方法特異性強。
　　 三、人工感染種

5、鴨生殖系統(tǒng)新城疫病毒的檢測應用本實驗室分離的一株經鴨胚傳遞的新城疫病毒SDFCH株，對42只無新城疫病毒感染的28周齡櫻桃谷種鴨進行人工感染試驗，試驗分A、B、C 3組，A組母鴨攻毒組，B組公鴨攻毒組，C組為對照組。攻毒4 d后，每隔2 d每組各撲殺2只，采集母鴨卵巢、輸卵管，公鴨采集睪丸、輸精管。對上述組織進行病毒分離鑒定，并利用已建立的RT-PCR方法進行F基因的擴增與同源性分析，確定在上述組織器官中是否存在鴨源新城疫病毒SDFCH

6、株。同時用已建立間接免疫熒光染色方法檢測輸卵管內新城疫病毒及病毒在輸卵管的分布情況。結果發(fā)現RT-PCR方法能在種鴨生殖系統(tǒng)各個組織中重新分離到新城疫病毒SDFCH株，輸卵管子宮部和蛋白分泌部纖毛柱狀上皮的纖毛細胞和分泌細胞內有陽性熒光信號存在。
　　 四、鴨源新城疫病毒垂直感染動物試驗應用本實驗室分離的一株經鴨胚傳遞的新城疫病毒SDFCH株，對68只無新城疫病毒感染的28周齡櫻桃谷種鴨進行人工感染試驗。攻毒采集母鴨卵巢、輸卵管

7、、未產出的種蛋，以及產出后及時消毒的種蛋，出殼后的雛鴨胎糞、腦、肺等。公鴨采集睪丸、輸精管、精液。結果H.E.染色后病理組織學變化，表現為輸卵管毛細血管出血，黏膜脫落，IFA檢測固有層淋巴細胞浸潤等輸卵管纖毛柱狀上皮的纖毛細胞和分泌細胞內有陽性信號存在，從母鴨及公鴨生殖系統(tǒng)各組織、胚蛋以及80％雛鴨中能分離和檢測到新城疫病毒SDFCH株。結果顯示，鴨源新城疫病毒能存在于母鴨輸卵管粘膜上皮細胞及公鴨精液中，并隨蛋白分泌、卵黃的形成、精液的