Notch1信號通路內(nèi)源性心肌保護作用的機制研究.pdf

1、假設(shè)Notch1作為內(nèi)源性心肌保護因子，通過與PI3K/Akt、JAK/Stat3相互整合，發(fā)揮心肌保護作用。因此，本研究將圍繞Notch1信號，以PI3K/Akt、JAK/Stat3信號通路為立足點，采用慢病毒載體構(gòu)建及其感染技術(shù)，制備相應(yīng)轉(zhuǎn)基因心肌細胞與整體大鼠，在確認已產(chǎn)生缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)、缺血后適應(yīng)(IPost)保護作用的基礎(chǔ)上，從細胞活力、細胞凋亡等角度觀察Notch1對心肌細胞的保護效應(yīng);在測定線粒體膜電位(△Ψm)、活

2、性氧(ROS)的同時，比較細胞質(zhì)與線粒體cytC的含量變化，檢測促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達改變，以闡述Notch信號通路抑制心肌凋亡的分子機理;研究不同Notch1表達水平對心肌細胞Akt、Stat3活性的影響，以探討Notch1與PI3K/Akt、JAK/Stat3信號通路的交叉整合機制;最后在大鼠離體心臟灌注模型上，對Notch1信號的心肌保護作用進行進一步的比較論證，努力闡明Notch信號通路心肌保護效應(yīng)的分子

3、機制，為缺血性心臟病的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　大鼠N1 ICD慢病毒表達及干擾載體構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建高滴度大鼠N1ICD慢病毒過表達載體(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干擾載體(LV-N1 ICD-shRNA)，為探討Notch1信號通路對缺血心肌的保護奠定研究基礎(chǔ)。
　　方法:以大鼠cDNA文庫為模板，PCR法擴增N1ICD，通過定向克隆構(gòu)建pGC-FU-N1ICD-3Flag穿梭質(zhì)粒;設(shè)計4對N1ICD

4、-shRNA寡核苷酸序列，以構(gòu)建GVC112-N1ICD-shRNA干擾質(zhì)粒，將pGC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-shRNA共轉(zhuǎn)293T細胞，檢測Flag的表達，篩選理想的GVC112-N1ICD-shRNA干擾質(zhì)粒。將pGC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-shRNA與pHelper1.0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)293T細胞，以包裝LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA，

5、分別利用Real-time PCR、藥物篩選法進行病毒滴度測定。
　　結(jié)果:pGC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-shRNA質(zhì)粒經(jīng)PCR、基因測序及Western-blotting驗證構(gòu)建成功，與pHelper1.0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)293T細胞后，取上清濃縮，分別獲得滴度LV-N1ICD和LV-N1 ICD-shRNA。
　　結(jié)論:LV-N1ICD和LV-N1 ICD-shRNA包裝成功，

6、具有Notch1信號通路生物學(xué)功能。
　　Notch1激活PI3K/Akt、JAK/Stat3信號通路，發(fā)揮內(nèi)源性心肌保護作用
　　目的:明確Notch1可減輕心肌缺血再灌注損傷(IRI)，探討Notch1內(nèi)源性心肌保護作用的分子機制。
　　方法:建立H9c2心肌細胞缺氧、缺氧/復(fù)氧(H/R)、IPC、IPost模型，Western-blotting檢測N1ICD/Hes1蛋白表達。LV-N1ICD及LV-N1 ICD

7、-shRNA分別感染H9c2心肌細胞，建立體外心肌H/R、IPC及IPost模型后，CCK-8檢測細胞活力;流式細胞儀分別檢測細胞凋亡、△Ψm、ROS;分離心肌細胞線粒體，檢測cytC在細胞質(zhì)和線粒體的表達;提總蛋白，Western-blotting檢測Bax、Bcl-xl、PTEN、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β、p-Stat3/Stat3蛋白表達。
　　結(jié)果:Notch1信號通路在心肌缺血性損傷時處于激活狀

8、態(tài)。Notch1信號激活后，可提高缺血后心肌細胞活力，抑制細胞凋亡，穩(wěn)定△Ψm，減少ROS形成;同時還可減少線粒體cytC向細胞質(zhì)的釋放，下調(diào)PTEN、Bax的表達，上調(diào)Bcl-xl、p-Akt、p-GSK-3β、p-Stat3表達。Notch1抑制后，Akt、Stat3活性減弱，IPC、IPost失去心肌保護作用。
　　結(jié)論:Notch1作為內(nèi)源性心肌保護因子，通過激活PI3K/Akt、JAK/Stat3信號通路，調(diào)節(jié)心肌凋亡相

9、關(guān)蛋白表達，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，從而減輕心肌IRI。
　　Notch1信號改善心肌缺血后的心功能
　　目的:探討Notch1信號對心肌缺血后心功能的改善作用。
　　方法:LV-N1ICD及LV-N1 ICD-shRNA分別感染Sprague Dawley大鼠，3w后建立Langendorff離體心臟灌注心肌缺血再灌注(I/R)、IPC、IPost模型，通過PowerLab系統(tǒng)實時觀察各時期血流動力學(xué)參數(shù)變化。于