Notch1信號蛋白在卵巢癌發(fā)生中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌是發(fā)生于卵巢組織的惡性腫瘤，占所有婦科惡性腫瘤的15％左右，僅次于宮頸癌，而死亡率卻位居第一。卵巢癌由于起病隱匿、早期不易發(fā)現(xiàn)，75％卵巢癌患者確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移[1,2]。因此，更好的了解卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制對其早期診斷、早期治療有著重要意義。
　　Notch信號通路是一條高度保守的決定細胞命運的信號通路[3]，其受體和配體是通過細胞間的相互作用調(diào)節(jié)細胞功能的I型跨膜蛋白[3,4]。在哺乳動物中，N

2、otch信號通路包括四個受體（Notch1-Notch4）和5個配體（Jagged-1,Jagged-2,Delta-like-1,Delta-like-3 and Delta-like-4and）[5]，相鄰細胞受體及配體之間相互作用誘導γ分泌酶介導的蛋白水解酶的釋放導致Notch胞內(nèi)段(NICD)的斷裂[6]，活化的NICD可進入細胞核與轉(zhuǎn)錄抑制因子CBF1結(jié)合，最終導致Hes、Hey等靶基因的釋放[7,8]，Notch信號通路及其

3、下游目的基因在細胞增值、分化、凋亡過程中有著重要作用[3]。
　　異常表達的Notch信號蛋白與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關[9,10]。Notch1表現(xiàn)為癌基因或抑癌基因取決于細胞的類型，它在鼠類皮膚腫瘤及非小細胞性肺癌中表現(xiàn)為抑癌基因作用[11,12]；而在許多其他腫瘤，如腎癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌中表現(xiàn)為癌基因作用[13]。最新文獻報道，Notch3及其目的基因Pbx1在卵巢癌中起癌基因作用[14,15]；Notch1在卵巢癌

4、患者腹水中有表達，并有促癌作用[16,17]。這些表明，Notch信號通路在卵巢癌的發(fā)生過程中可能起癌基因作用。Notch信號蛋白與卵巢癌的關系是一個新的研究領域，也為卵巢癌的基因治療提供了新的思路。
　　目的：
　?。?）探討Notch1在卵巢癌形成和轉(zhuǎn)化過程中的表達特點及其與卵巢癌的臨床病理學參數(shù)的關系；
　?。?）檢測卵巢癌細胞系A2780,SKOV3,HO-8910,HO-8910PM和卵巢上皮細胞IOSE14

5、4中Notch1及下游基因hes1的表達，篩選Notch1信號蛋白高表達的細胞系，為進一步實驗研究提供實驗依據(jù)；
　　（3）檢測γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路后Notch1及hes1基因的變化情況及對卵巢癌細胞A2780生長、凋亡等生物學行為的影響，為進一步實驗研究提供實驗依據(jù)；
　?。?）檢測γ-分泌酶抑制劑DAPT下調(diào)Notch信號通路對卵巢癌鉑類耐藥的影響。
　　方法：
　　（1）采用免疫組

6、織化學SP染色法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Western blotting檢測109例卵巢癌（其中65例為單側(cè)卵巢癌）、65例單側(cè)卵巢癌患者健側(cè)卵巢（配對對照）及48例正常卵巢組織（正常對照）中Notch1的表達，采用SPSS14.0軟件的卡方檢驗統(tǒng)計方法進行分析。
　?。?）采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Western blotting檢測四株卵巢癌細胞（A2780,SKOV3,HO-8910,HO-891

7、0PM）及一株卵巢上皮細胞（IOSE144）中Notch1及其下游基因hes1的表達情況；采用MTT、流式細胞術、ELISA及克隆形成實驗檢測γ-分泌酶抑制劑DAPT下調(diào)Notch信號通路對卵巢癌細胞生物學行為的影響。
　　（3）采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Westernblotting檢測γ-分泌酶抑制劑DAPT處理卵巢癌鉑類耐藥細胞A2780/CP70后Notch信號通路下游基因hes1的變化情況，采用MTT、流式

8、細胞術、ELISA及克隆形成實驗檢測DAPT聯(lián)合順鉑（Cis-DDP）對卵巢癌鉑類耐藥細胞A2780/CP70生物學行為的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）Notch1在卵巢癌中的表達與卵巢癌的組織分化程度及FIGO分期相關（P﹤0.05），而與年齡、家族史、腫瘤位置、有無腹水、有無周圍組織浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型差異無顯著性（P＞0.05）；
　?。?）Notch1及其下游hes1基因在卵巢癌細胞A2780中高表達

9、；
　　（3）DAPT能抑制卵巢癌細胞A2780Notch1及hes1的表達，并呈時間、劑量依賴性；
　?。?）DAPT下調(diào)Notch1表達可抑制A2780細胞生長并誘導細胞G1期阻滯；
　?。?）DAPT下調(diào)Notch1表達可誘導A2780細胞凋亡；
　　（6）DAPT能下調(diào)卵巢癌鉑類耐藥細胞A2780/CP70Notch信號通路下游hes1基因的表達；
　　（7）DAPT能促進Cis-DDP誘導細胞生長

10、抑制；
　?。?）DAPT聯(lián)合Cis-DDP用藥能誘導卵巢癌鉑類耐藥細胞A2780/CP70細胞G2期阻滯；
　?。?）DAPT能促進Cis-DDP誘導卵巢癌鉑類耐藥細胞A2780/CP70凋亡。
　　結(jié)論：
　?。?）Notch1在卵巢癌組織中的表達與卵巢癌組織分化程度及FIGO分期相關，臨床分期越高、分化程度越低，Notch1的表達越低；反之，Notch1的表達越高，可能與其惡性程度有關。
　?。?）N

11、otch1及其下游hes1基因在多種卵巢癌細胞系中均有表達，且在A2780細胞系中表達較高，可選A2780細胞作為靶細胞進行更深入的研究。
　?。?）DAPT可下調(diào)A2780細胞Notch1及其下游hes1的表達，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性；同時可引起A2780細胞生長抑制、細胞克隆數(shù)減少，并引起細胞G1期阻滯；還能引起A2780細胞凋亡，并呈時間依賴性，γ-分泌酶抑制劑DAPT可能成為卵巢癌治療的一個新靶點。
　?。?）DAP

12、T阻斷Notch信號通路可增強卵巢癌鉑類耐藥細胞A2780/CP70對Cis-DDP的敏感性，協(xié)同低劑量Cis-DDP誘導A2780/CP70細胞生長抑制及凋亡，DAPT-順鉑聯(lián)合用藥可能成為卵巢癌治療的一個新靶點。
　　本實驗結(jié)果顯示,Notch1及其下游hes1基因在卵巢癌組織及細胞系中均有表達，提示Notch信號通路可能是卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機制之一；γ-分泌酶抑制劑DAPT下調(diào)Notch信號通路可抑制卵巢癌A2780細胞生長