Polι與PolιS5在移行細胞癌組織的表達及對UVC導致的DNA損傷復制的功能對比研究.pdf

1、研究背景與目的： 腫瘤分子遺傳學研究普遍認為腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因改變多步驟的過程。目前腫瘤的病因學主要包括：病毒、化學因素、物理因素、激素因素。膀胱癌在我國男性泌尿生殖系腫瘤中發(fā)生率第一，而且近年有發(fā)生率增加和年輕化趨勢。 本課題擬對PolιS5與Polι的功能進行對比研究，同時探討Polι在膀胱腫瘤細胞株表達的意義，并進一步檢測PolιS5與Polι在移行細胞癌組織是否高表達，與移行細胞癌組織的異質性生物學行為是否相

2、關。本研究將對我們了解PolιS5的功能，進一步理解膀胱腫瘤的發(fā)生及其高異質性的分子機制，具有重要的理論意義。 方法： 1、PolιS5與Polι在膀胱腫瘤細胞株BIU87、T24的表達。培養(yǎng)膀胱腫瘤細胞株BIU87、T24，收集臨床膀胱正常粘膜組織作為對照。臨床標本膀胱正常粘膜組織15例來自第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院泌尿外科研究所，正常膀胱粘膜組織取自距膀胱腫瘤2cm以上的正常粘膜，標本切取后均立即放入液氮凍存，防止RNA降

3、解。采用Tripure提取組織和細胞總RNA，RT-PCR檢測PolιS5與PolιmRNA在膀胱腫瘤細胞株BIU87、T24和膀胱正常粘膜組織的表達。 2、pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5的轉化和鑒定。pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5由第三軍醫(yī)大學生化與分子生物學教研室楊勁副教授贈送，利用氯化鈣法將三個質粒分別轉化入DH5α大腸桿菌，經過進

4、行質粒小抽，初步鑒定后，進行測序，將測序結果利用生物信息技術BLAT(www.genome.ucsc.edu)進行鑒定。以證明pEGFP-C1-PolιS5的目的片段PolιS5比pEGFP-C1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外顯子，為我們進一步對Polι與PolιS5的功能對比研究奠定基礎。 3、Polι與PolιS5對UVC導致的DNA損傷的功能對比研究。通過用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞在受到紫外線UVC照射后P

5、olι及：PolιS5在細胞核分布的改變分析其功能差異。培養(yǎng)HEK293細胞，利用陽離子脂質體瞬時轉染的方法，將質粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5分別轉染HEK293細胞，36小時后，用紫外線UVC(15J/m2)照射使細胞DNA損傷，12小時后用激光共聚焦顯微鏡觀察在質粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5分別瞬時轉染的HEK293細胞，細胞核綠色熒

6、光蛋白在紫外線照射后分布的改變。 4.PolιS5與Polι在臨床移行細胞癌組織標本的表達。臨床標本來自第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院泌尿外科研究所，膀胱正常粘膜組織15例，膀胱腫瘤組織28例，腎盂癌組織11例；移行細胞癌組織Ⅰ級13例，Ⅱ級16例，Ⅲ級10例。組織標本取自2005年5月2006年9月在西南醫(yī)院行膀胱腫瘤切除術及腎盂癌根治手術的患者，經過病理檢查證實，均為移行上皮細胞癌。在腫瘤原發(fā)灶上切取200mg左右組織作為癌組織標本；

7、正常膀胱粘膜組織來自距膀胱腫瘤2cm以上的正常粘膜，作為對照。標本切取后均立即放入液氮凍存，防止RNA降解。采用Tripure提取組織和細胞總RNA，RT-PCR檢測PolιS5與PolιmRNA在臨床移行細胞癌組織標本的表達。 結果： 1、成功培養(yǎng)膀胱腫瘤細胞株BIU87、T24；通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在BIU87和T24腫瘤細胞株有豐富的PolιmRNA表達，且較膀胱正常粘膜組織表達有非常顯著差異(P＜0.01)

8、；并發(fā)現(xiàn)PolιS5在膀胱腫瘤細胞株有表達，但在膀胱正常粘膜組織未檢測到PolιS5的表達；在BIU87和T24腫瘤細胞株，Polι的表達較PolιS5表達豐富，并有非常顯著差異(P＜0.01)。膀胱腫瘤細胞株BIU87及T24中，Polι的表達顯著增加，由于Poh，高水平的表達可能導致DNA跨損傷復制過程中基因的高突變，因此Polι的高表達可能與膀胱腫瘤的發(fā)生相關；在膀胱腫瘤細胞株BIU87及T24中，發(fā)現(xiàn)PolιS5的表達，在文獻中

9、尚未見報道；PolιS5在膀胱腫瘤細胞株表達的意義尚待研究。 2、成功將質粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5轉化DH5α大腸桿菌，并進行質粒小抽，初步鑒定后將質粒進行測序，將測序結果利用生物信息技術BLAT(www.genome.ucsc.edu)證明：pEGFP-C1-PolιS5的目的片段PolιS5比pEGFP-C1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外顯子，為我們進一步

10、對Polι與PolιS5的功能對比研究奠定了基礎。 3、在質粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5瞬時轉染的HEK293細胞的細胞核均有綠色熒光，且很均勻，質粒轉染率幾乎達100％。在紫外線UVC(15J/m2)照射三種細胞后，質粒pEGFP-C1轉染的HEK293細胞核熒光仍然很均勻，pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5轉染的HEK293細胞核均出現(xiàn)熒光聚集現(xiàn)象，同

11、時發(fā)現(xiàn)質粒pEGFP-C1-PoliotaS5(20％)轉染的HEK293細胞核出現(xiàn)熒光聚集現(xiàn)象的細胞比例明顯高于質粒pEGFP-C1-Polι(6％)轉染的HEK293細胞核出現(xiàn)熒光聚集現(xiàn)象的細胞比例。說明：PolιS5與Polι在紫外線UVC導致的DNA損傷的跨損傷復制過程中可能起著相似的作用，而且PolιS5可能比Polι更敏感，結合DNA更緊密，但更詳細的過程尚須進一步研究；PolιS5可能對UVC損傷較補骨脂素、順鉑導致的DN

12、A損傷有一定的依賴性。 4、通過RT-PCR檢測，PolιmRNA在膀胱正常粘膜組織、膀胱腫瘤組織及腎盂癌組織均有表達，Polι在膀胱腫瘤及腎盂癌組織的表達顯著高于膀胱正常粘膜組織的表達(P＜0.01)；Polι在Ⅰ級移行細胞癌組織和Ⅱ級移行細胞癌組織的表達顯著高于膀胱正常粘膜組織的表達(P＜0.05；P＜0.01)；在Ⅲ級移行細胞癌組織的表達顯著高于Ⅰ級移行細胞癌組織(P＜0.05)。但我們未檢測到PolιS5在膀胱正常粘膜、

13、膀胱腫瘤、腎盂癌組織的表達。結果表明：膀胱腫瘤組織和腎盂癌組織Polι的表達顯著增加，可能與膀胱腫瘤的發(fā)生有關；移行細胞癌組織Polι的表達顯著增加與膀胱腫瘤、腎盂癌的異質性相關；在移行細胞癌組織未發(fā)現(xiàn)PolιS5的表達，但不能排除PolιS5在其它組織的豐富表達。 結論： 1、在膀胱腫瘤細胞株BIU87及T24中，發(fā)現(xiàn)Polι的剪接體PolιS5； 2、PolιS5與Polι在對紫外線UVC導致的DNA損傷后的