RIP2小干擾RNA表達質(zhì)粒對小鼠巨噬細胞及內(nèi)毒素血癥的影響.pdf

1、背景和目的： 盡管廣譜抗菌素廣泛應(yīng)用，細菌感染仍是住院病人死亡的主要原因。細菌及其產(chǎn)物會激活單核巨噬細胞系統(tǒng)釋放大量炎癥介質(zhì)，引起內(nèi)毒素血癥和多臟器功能衰竭。阻斷這些炎癥介質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)可降低感染急性期死亡率。目前發(fā)現(xiàn)機體通過細胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和細胞內(nèi)的NODs受體識別病原體相關(guān)分子模式 (pathogen-associated molecular patteros，PA

2、MPs)，引起免疫炎癥反應(yīng)。RIP2是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是TLRs及NODs信號通路的下游因子，RIP2缺陷的巨噬細胞予LPS刺激后NF-κB激活下降，炎癥細胞因子如TNF-α等產(chǎn)生明顯減少，RIP2缺陷的小鼠能抵御內(nèi)毒素的致死效應(yīng)；而NODs通過募集RIP2激活NF-κB，RIP2顯性失活可抑制巨噬細胞NOD1介導(dǎo)的NF-κB激活。故RIP2在介導(dǎo)TLRs和NODs的信號級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用，引起宿主的天然和獲得

3、性免疫反應(yīng)，激活NF-κB并產(chǎn)生炎癥細胞因子。本課題應(yīng)用RNA干擾技術(shù)阻斷巨噬細胞RIP2的表達，研究其對巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子的影響及其對小鼠內(nèi)毒素血癥的保護效應(yīng)。 方法：應(yīng)用重組DNA技術(shù)和pRNAT-U6.1載體構(gòu)建小鼠RIP2的siRNA真核表達質(zhì)粒并測序。轉(zhuǎn)染巨噬細胞株RAW264.7后用RT-PCR和 Western blot方法檢測細胞RIP2的mRNA和蛋白表達，MTT 法測定細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡率；不

4、同濃度LPS刺激不同時間后，用ELISA法測定細胞 INF-α，半定量Western測定HMGB1的水平。RIP2 siRNA表達質(zhì)粒經(jīng)小鼠尾靜脈注射后，予LPS腹腔注射刺激小鼠，觀察小鼠死亡率，用RT-PCR方法檢測肝組織RIP2mRNA表達，Western blot方法檢測肝組織RIP2和HMGB1的蛋白表達，ELISA法測定血清 TNF-α的水平。 結(jié)果： 1、構(gòu)建的RIP2 siRNA表達質(zhì)粒的序列與我們設(shè)計的一

5、致。 2、RIP2 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，證實質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入細胞。 3、Ⅲ號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞RIP2mRNA和蛋白表達減少，細胞增殖較空白質(zhì)粒、Ⅰ號質(zhì)粒和Ⅱ號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯增加而細胞凋亡減少；予LPS刺激后Ⅲ號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的TNF-αHMGBl濃度較其它組減少。 4、RIP2表達質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染后，Ⅲ號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組內(nèi)毒素血癥小鼠的生存率較其它組高，而肝組織RIP2mRNA和蛋白表達較低，HMGB1蛋白表