白細(xì)胞去除術(shù)對(duì)內(nèi)毒素血癥犬肺損傷的影響及機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute resp iratorydistress syndrome，ARDS)是由多種炎性介質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與，并呈級(jí)聯(lián)放大的瀑布樣炎癥繼發(fā)性彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷、以肺.血屏障通透性升高導(dǎo)致富蛋白液滲出和頑固的低氧血癥為特征的臨床綜合征，盡管應(yīng)用先進(jìn)的重癥監(jiān)護(hù)及治療，并改進(jìn)了治療策略，ALI/ARDS迄今仍具有高發(fā)病率及高病死率。數(shù)十年來(lái)，眾多針對(duì)ALI/A

2、RDS的預(yù)防和治療努力收效甚微。迄今，ALI/ARDS仍是臨床危重病學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。因此，對(duì)于ALI/ARDS或ALI/ARDS高風(fēng)險(xiǎn)患者迫切需要發(fā)展一種新的預(yù)防和治療策略。目前公認(rèn)，肺內(nèi)中性粒細(xì)胞扣押、滲出和引起的肺炎性損害在ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用，中性粒細(xì)胞活化并產(chǎn)生的各種有害介質(zhì)介導(dǎo)了ALI/ARDS時(shí)肺的炎性損害，其中，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶是中性粒細(xì)胞中最重要的酶類炎性介質(zhì)，在ALI/ARDS的發(fā)生中起

3、最為重要的作用。循環(huán)血白細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞升高，是各種細(xì)菌性膿毒癥最重要的特征，國(guó)內(nèi)外既往的研究己證實(shí)，中性粒細(xì)胞在死于膿毒癥ALI/ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液中遠(yuǎn)較未死亡者為高。由于肺及支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞來(lái)源于循環(huán)血，我們推測(cè)，抑制或部分去除循環(huán)血中白細(xì)胞可能會(huì)成為新的ALI/ARDS預(yù)防和治療的有效手段。既往在體的研究證實(shí)，通過(guò)抑制循環(huán)血中的中性粒細(xì)胞，可減少受試動(dòng)物肺病理?yè)p傷，最近一項(xiàng)去除大鼠內(nèi)毒素血癥循環(huán)血白

4、細(xì)胞的研究也取得了類似的結(jié)果。上述針對(duì)體內(nèi)所有白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的技術(shù)盡管可以減輕受試動(dòng)物的炎性損傷，但均來(lái)自于小的嚙齒動(dòng)物，同時(shí)，上述通過(guò)抗體或細(xì)胞毒性藥物抑制或破壞體內(nèi)白細(xì)胞，存在嚴(yán)重副作用及感染風(fēng)險(xiǎn)，難以用于臨床防治膿毒癥ALI/ARDS。白細(xì)胞去除術(shù)是一種通過(guò)特定裝置在體或離體去除血液中部分白細(xì)胞、以減少白細(xì)胞炎性損傷為目的治療技術(shù)，在歐洲廣泛用于難治性自身免疫性疾病，本研究擬通過(guò)白細(xì)胞去除術(shù)去除內(nèi)毒素血癥犬部分循環(huán)血WBC和P

5、MN的數(shù)量，觀察減少循環(huán)血PMN對(duì)內(nèi)毒素血癥犬急性肺損傷的影響，從而為ALI/ARDS的臨床防治開劈新的思路及方法。
　　 目的：觀察白細(xì)胞去除對(duì)內(nèi)毒素血癥犬急性肺損傷預(yù)防作用及機(jī)制；探討白細(xì)胞去除術(shù)在膿毒癥患者中潛在臨床應(yīng)用意義。
　　 方法：24只健康雄性雜種犬以數(shù)字隨機(jī)表法分為內(nèi)毒素組(LPS組)、偽去白細(xì)胞組(sham組)、白細(xì)胞去除組(LCAP組)(n=8)。動(dòng)物麻醉、監(jiān)測(cè)、機(jī)械通氣和血管準(zhǔn)備完成、且血液動(dòng)力學(xué)

6、穩(wěn)定后，各組動(dòng)物均靜脈泵入LPS(2 mg/kg；E.coliO55：B5)造內(nèi)毒素血癥模型。LCAP組在LPS輸注開始后16h，以連續(xù)血流血細(xì)胞分離機(jī)和單核細(xì)胞程序(MNC)分離循環(huán)血白細(xì)胞，據(jù)受試動(dòng)物體重、身長(zhǎng)、血細(xì)胞壓積和目標(biāo)白細(xì)胞水平設(shè)置參數(shù)分離周期數(shù)、血流速。分離過(guò)程中監(jiān)測(cè)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平適當(dāng)調(diào)整分離周期數(shù)，并據(jù)白細(xì)胞收集袋中白細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)結(jié)果評(píng)估分離效果。sham LCAP執(zhí)行操作和程序同LCAP組，但通過(guò)將白細(xì)胞收集袋

7、中分離物持續(xù)回輸入血進(jìn)行偽白細(xì)胞去除。選擇16h行白細(xì)胞去除是基于預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，靜脈輸入LPS后，白細(xì)胞迅速下降，6-8小時(shí)后開始回升，約在16小時(shí)后恢復(fù)至正常水平。目標(biāo)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(8.0×109/L)確定系基于預(yù)實(shí)驗(yàn)中所測(cè)(10只健康受試犬種)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(8.36-16.4×109/L)下限水平。為穩(wěn)定血液動(dòng)力學(xué)，適量給予輸液或血管活性藥物。試驗(yàn)時(shí)測(cè)定外周血WBC和PMN計(jì)數(shù)、血清中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)

8、的基礎(chǔ)水平、并在LPS輸注0、2、8、16、20、24和36小時(shí)重復(fù)測(cè)定。外周血標(biāo)本收集后4℃、3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，收集上清液立即凍存于-80℃?zhèn)錅y(cè)NE及MPO(酶聯(lián)免疫吸附法，ELISA)。LPS輸注后36h放血處死動(dòng)物，立即剖胸取右中肺葉行支氣管肺泡灌洗并收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，3ml用于立即檢測(cè)BALF中WBC和PMN計(jì)數(shù)，余液分裝后于-80℃凍存?zhèn)錅y(cè)NE。同時(shí)右下肺葉尖部用鋒利刀片切取數(shù)塊分別固定于4%多聚甲醛和2

9、.5%戊二醛中分別行普通病理、肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡、掃描和透射電鏡檢查。同法另取左下肺葉數(shù)塊備測(cè)肺實(shí)/干重比、肺核因子-κBp65(NF-κB subunit p65)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(Western Blot及ELISA法)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0：計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析或單因素方差分析，組間的兩兩多重比較采用LSD法；計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.ALI/ARDS發(fā)生率：LPS輸注后36h，LPS組、Sham組、LCAP組分別有7(7/8)、7(7/8)和3(3/8)例受試犬發(fā)生ALI(p<0.05)，無(wú)ARDS發(fā)生。ALI發(fā)生的時(shí)間19h-36h，平均31h。
　　 2.LPS及LCAP對(duì)循環(huán)血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響：LPS輸注后循環(huán)血WBC及PMN計(jì)數(shù)迅速下降，PMN比例明顯降低，6-8h后WBC計(jì)數(shù)及PMN逐漸

11、上升，約16h后WBC恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，然后進(jìn)一步上升，同時(shí)PMN比例升高；
　　 LCAP組16h時(shí)開始行LCAP，持續(xù)約4h，結(jié)果顯示，與LPS及sham組比較，LCAP可明顯降低外周血WBC及PMN計(jì)數(shù)，此趨勢(shì)持續(xù)4小時(shí)以上(20h：p<0.01；24h：p<0.05)，同時(shí)，各組動(dòng)物間WBC及PMN計(jì)數(shù)均值亦有顯著性差異，LCAP組明顯低于LPS及sham組(p<0.05)。而LPS與Sham組間比較無(wú)顯著差異性。

12、　　 3.LPS和LCAP對(duì)血清NE水平的影響：LPS輸注后血清NE水平持續(xù)升高，LCAP部分去除循環(huán)血WBC和PMN后，血清NE水平絕對(duì)值并無(wú)下降，但LCAP結(jié)束時(shí)及4h后LCAP組血清NE水平仍明顯低于LPS和Sham組(20h：p<0.01；24h：p<0.05)，比較受試動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)NE均值，LCAP組亦低于LPS和Sham組(p<0.05)。
　　 4.各組間BALF蛋白濃度、肺NF-κB含量改變：LCAP組BALF

13、蛋白濃度、肺實(shí)質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)及肺NF-κB含量均明顯低于LPS組及Sham組(p<0.01或p<0.05)。LCAP組肺間質(zhì)水腫相對(duì)較輕，但BALF中PMN計(jì)數(shù)、肺實(shí)質(zhì)內(nèi)PMN數(shù)量、TNF-α及MDA水平均無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　 5.肺組織普通病理觀察及肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(/10HP)：各組犬肺組織均可見(jiàn)中性粒細(xì)胞微血管內(nèi)扣押、肺實(shí)質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)。LPS組、Sham組及LCAP三組間肺組織中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)顯著性差異(27

14、.3±5.4，24.9±4.1 vs22.6±4.7)(p>0.05)，但LCAP組肺間質(zhì)水腫相對(duì)較輕。
　　 6.肺實(shí)質(zhì)凋亡細(xì)胞觀察：三組間肺實(shí)質(zhì)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)(/HP)有顯著性差異：LCAP組明顯低于LPS組和Sham組(91.0±9.5 vs101.8±10.2和104.8±11.1)(p<0.05)，LPS組和Sham組間肺實(shí)質(zhì)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　 7.發(fā)生與未發(fā)生ALI動(dòng)物循環(huán)血PMN及

15、NE觀察：發(fā)生ALI受試動(dòng)物循環(huán)血PMN及NE均顯著高于未發(fā)生ALI(P<0.05)。
　　 8.PMN、NE與氧合指數(shù)：平均循環(huán)血PMN計(jì)數(shù)與平均血清NE水平呈正相關(guān)，二者與受試犬36小時(shí)之氧合指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.雜種犬是內(nèi)毒素血癥ALI/ARDS模型較為理想的受試動(dòng)物：雜種犬體形較大，白細(xì)胞及動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)與人類接近，內(nèi)毒素血癥后達(dá)到ALI/ARDS診斷標(biāo)

16、準(zhǔn)需要較長(zhǎng)時(shí)間，與人類ALI/ARDS發(fā)病病程較接近，受試犬ALI發(fā)生前后可給予機(jī)械通氣及其它生命支持處理。其ALI/ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)可采用臨床標(biāo)準(zhǔn)，克服了小動(dòng)物發(fā)生ALI/ARDS后很快死亡、不能進(jìn)行進(jìn)一步研究、與人類病程及治療經(jīng)過(guò)差異過(guò)大的局限。
　　 2.LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥犬循環(huán)血白細(xì)胞的變化規(guī)律：早期中性粒細(xì)胞迅速降低，6-8小時(shí)后緩慢上升，約16小時(shí)后恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；并隨時(shí)間進(jìn)一步升高。
　　 3.去除白細(xì)

17、胞的方法及標(biāo)準(zhǔn)。本研究證實(shí)，在充分臨床保障的基礎(chǔ)上，人用血白細(xì)胞分離機(jī)可用于內(nèi)毒素血癥雜種犬分離白細(xì)胞。本研究去除白細(xì)胞時(shí)機(jī)、循環(huán)血白細(xì)胞目標(biāo)水平可減輕肺實(shí)質(zhì)損害、降低ALI的發(fā)生率。
　　 4.白細(xì)胞去除有效減少肺實(shí)質(zhì)損害的可能機(jī)制：1)減少循環(huán)血中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶水平；后者對(duì)肺氣血屏障的損害減輕、對(duì)肺泡表面活性物質(zhì)的分解減少；2)減少肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞NF-κB表達(dá)、進(jìn)而下調(diào)NF-κB調(diào)控的各種損害性介質(zhì)的表達(dá)；3)減輕肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞