白細胞去除術對內(nèi)毒素血癥犬肺損傷的影響及機制研究.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute resp iratorydistress syndrome，ARDS)是由多種炎性介質及效應細胞共同參與，并呈級聯(lián)放大的瀑布樣炎癥繼發(fā)性彌漫性肺實質損傷、以肺.血屏障通透性升高導致富蛋白液滲出和頑固的低氧血癥為特征的臨床綜合征，盡管應用先進的重癥監(jiān)護及治療，并改進了治療策略，ALI/ARDS迄今仍具有高發(fā)病率及高病死率。數(shù)十年來，眾多針對ALI/A

2、RDS的預防和治療努力收效甚微。迄今，ALI/ARDS仍是臨床危重病學研究的熱點和難點。因此，對于ALI/ARDS或ALI/ARDS高風險患者迫切需要發(fā)展一種新的預防和治療策略。目前公認，肺內(nèi)中性粒細胞扣押、滲出和引起的肺炎性損害在ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展中起到了關鍵的作用，中性粒細胞活化并產(chǎn)生的各種有害介質介導了ALI/ARDS時肺的炎性損害，其中，中性粒細胞彈性蛋白酶是中性粒細胞中最重要的酶類炎性介質，在ALI/ARDS的發(fā)生中起

3、最為重要的作用。循環(huán)血白細胞，特別是中性粒細胞升高，是各種細菌性膿毒癥最重要的特征，國內(nèi)外既往的研究己證實，中性粒細胞在死于膿毒癥ALI/ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液中遠較未死亡者為高。由于肺及支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細胞來源于循環(huán)血，我們推測，抑制或部分去除循環(huán)血中白細胞可能會成為新的ALI/ARDS預防和治療的有效手段。既往在體的研究證實，通過抑制循環(huán)血中的中性粒細胞，可減少受試動物肺病理損傷，最近一項去除大鼠內(nèi)毒素血癥循環(huán)血白

4、細胞的研究也取得了類似的結果。上述針對體內(nèi)所有白細胞及中性粒細胞的技術盡管可以減輕受試動物的炎性損傷，但均來自于小的嚙齒動物，同時，上述通過抗體或細胞毒性藥物抑制或破壞體內(nèi)白細胞，存在嚴重副作用及感染風險，難以用于臨床防治膿毒癥ALI/ARDS。白細胞去除術是一種通過特定裝置在體或離體去除血液中部分白細胞、以減少白細胞炎性損傷為目的治療技術，在歐洲廣泛用于難治性自身免疫性疾病，本研究擬通過白細胞去除術去除內(nèi)毒素血癥犬部分循環(huán)血WBC和P

5、MN的數(shù)量，觀察減少循環(huán)血PMN對內(nèi)毒素血癥犬急性肺損傷的影響，從而為ALI/ARDS的臨床防治開劈新的思路及方法。
　　 目的：觀察白細胞去除對內(nèi)毒素血癥犬急性肺損傷預防作用及機制；探討白細胞去除術在膿毒癥患者中潛在臨床應用意義。
　　 方法：24只健康雄性雜種犬以數(shù)字隨機表法分為內(nèi)毒素組(LPS組)、偽去白細胞組(sham組)、白細胞去除組(LCAP組)(n=8)。動物麻醉、監(jiān)測、機械通氣和血管準備完成、且血液動力學

6、穩(wěn)定后，各組動物均靜脈泵入LPS(2 mg/kg；E.coliO55：B5)造內(nèi)毒素血癥模型。LCAP組在LPS輸注開始后16h，以連續(xù)血流血細胞分離機和單核細胞程序(MNC)分離循環(huán)血白細胞，據(jù)受試動物體重、身長、血細胞壓積和目標白細胞水平設置參數(shù)分離周期數(shù)、血流速。分離過程中監(jiān)測外周血白細胞計數(shù)水平適當調(diào)整分離周期數(shù)，并據(jù)白細胞收集袋中白細胞計數(shù)監(jiān)測結果評估分離效果。sham LCAP執(zhí)行操作和程序同LCAP組，但通過將白細胞收集袋

7、中分離物持續(xù)回輸入血進行偽白細胞去除。選擇16h行白細胞去除是基于預實驗中發(fā)現(xiàn)，靜脈輸入LPS后，白細胞迅速下降，6-8小時后開始回升，約在16小時后恢復至正常水平。目標白細胞計數(shù)(8.0×109/L)確定系基于預實驗中所測(10只健康受試犬種)的白細胞計數(shù)(8.36-16.4×109/L)下限水平。為穩(wěn)定血液動力學，適量給予輸液或血管活性藥物。試驗時測定外周血WBC和PMN計數(shù)、血清中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO)

8、的基礎水平、并在LPS輸注0、2、8、16、20、24和36小時重復測定。外周血標本收集后4℃、3000轉離心10分鐘，收集上清液立即凍存于-80℃?zhèn)錅yNE及MPO(酶聯(lián)免疫吸附法，ELISA)。LPS輸注后36h放血處死動物，立即剖胸取右中肺葉行支氣管肺泡灌洗并收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，3ml用于立即檢測BALF中WBC和PMN計數(shù)，余液分裝后于-80℃凍存?zhèn)錅yNE。同時右下肺葉尖部用鋒利刀片切取數(shù)塊分別固定于4%多聚甲醛和2

9、.5%戊二醛中分別行普通病理、肺實質細胞凋亡、掃描和透射電鏡檢查。同法另取左下肺葉數(shù)塊備測肺實/干重比、肺核因子-κBp65(NF-κB subunit p65)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(Western Blot及ELISA法)。統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0：計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，數(shù)據(jù)采用重復測量資料方差分析或單因素方差分析，組間的兩兩多重比較采用LSD法；計數(shù)資料采用X2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計

10、學意義。
　　 結果：
　　 1.ALI/ARDS發(fā)生率：LPS輸注后36h，LPS組、Sham組、LCAP組分別有7(7/8)、7(7/8)和3(3/8)例受試犬發(fā)生ALI(p<0.05)，無ARDS發(fā)生。ALI發(fā)生的時間19h-36h，平均31h。
　　 2.LPS及LCAP對循環(huán)血白細胞及中性粒細胞計數(shù)的影響：LPS輸注后循環(huán)血WBC及PMN計數(shù)迅速下降，PMN比例明顯降低，6-8h后WBC計數(shù)及PMN逐漸

11、上升，約16h后WBC恢復至基礎水平，然后進一步上升，同時PMN比例升高；
　　 LCAP組16h時開始行LCAP，持續(xù)約4h，結果顯示，與LPS及sham組比較，LCAP可明顯降低外周血WBC及PMN計數(shù)，此趨勢持續(xù)4小時以上(20h：p<0.01；24h：p<0.05)，同時，各組動物間WBC及PMN計數(shù)均值亦有顯著性差異，LCAP組明顯低于LPS及sham組(p<0.05)。而LPS與Sham組間比較無顯著差異性。

12、　　 3.LPS和LCAP對血清NE水平的影響：LPS輸注后血清NE水平持續(xù)升高，LCAP部分去除循環(huán)血WBC和PMN后，血清NE水平絕對值并無下降，但LCAP結束時及4h后LCAP組血清NE水平仍明顯低于LPS和Sham組(20h：p<0.01；24h：p<0.05)，比較受試動物各時間點NE均值，LCAP組亦低于LPS和Sham組(p<0.05)。
　　 4.各組間BALF蛋白濃度、肺NF-κB含量改變：LCAP組BALF

13、蛋白濃度、肺實質凋亡細胞數(shù)及肺NF-κB含量均明顯低于LPS組及Sham組(p<0.01或p<0.05)。LCAP組肺間質水腫相對較輕，但BALF中PMN計數(shù)、肺實質內(nèi)PMN數(shù)量、TNF-α及MDA水平均無明顯差異(p>0.05)。
　　 5.肺組織普通病理觀察及肺組織內(nèi)中性粒細胞計數(shù)(/10HP)：各組犬肺組織均可見中性粒細胞微血管內(nèi)扣押、肺實質內(nèi)浸潤。LPS組、Sham組及LCAP三組間肺組織中性粒細胞計數(shù)無顯著性差異(27

14、.3±5.4，24.9±4.1 vs22.6±4.7)(p>0.05)，但LCAP組肺間質水腫相對較輕。
　　 6.肺實質凋亡細胞觀察：三組間肺實質凋亡細胞計數(shù)(/HP)有顯著性差異：LCAP組明顯低于LPS組和Sham組(91.0±9.5 vs101.8±10.2和104.8±11.1)(p<0.05)，LPS組和Sham組間肺實質凋亡細胞計數(shù)無明顯差異(p>0.05)。
　　 7.發(fā)生與未發(fā)生ALI動物循環(huán)血PMN及

15、NE觀察：發(fā)生ALI受試動物循環(huán)血PMN及NE均顯著高于未發(fā)生ALI(P<0.05)。
　　 8.PMN、NE與氧合指數(shù)：平均循環(huán)血PMN計數(shù)與平均血清NE水平呈正相關，二者與受試犬36小時之氧合指數(shù)呈負相關，均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 結論：
　　 1.雜種犬是內(nèi)毒素血癥ALI/ARDS模型較為理想的受試動物：雜種犬體形較大，白細胞及動脈血氣分析指標與人類接近，內(nèi)毒素血癥后達到ALI/ARDS診斷標

16、準需要較長時間，與人類ALI/ARDS發(fā)病病程較接近，受試犬ALI發(fā)生前后可給予機械通氣及其它生命支持處理。其ALI/ARDS診斷標準可采用臨床標準，克服了小動物發(fā)生ALI/ARDS后很快死亡、不能進行進一步研究、與人類病程及治療經(jīng)過差異過大的局限。
　　 2.LPS誘導的內(nèi)毒素血癥犬循環(huán)血白細胞的變化規(guī)律：早期中性粒細胞迅速降低，6-8小時后緩慢上升，約16小時后恢復至基礎水平；并隨時間進一步升高。
　　 3.去除白細

17、胞的方法及標準。本研究證實，在充分臨床保障的基礎上，人用血白細胞分離機可用于內(nèi)毒素血癥雜種犬分離白細胞。本研究去除白細胞時機、循環(huán)血白細胞目標水平可減輕肺實質損害、降低ALI的發(fā)生率。
　　 4.白細胞去除有效減少肺實質損害的可能機制：1)減少循環(huán)血中性粒細胞彈性蛋白酶水平；后者對肺氣血屏障的損害減輕、對肺泡表面活性物質的分解減少；2)減少肺實質細胞NF-κB表達、進而下調(diào)NF-κB調(diào)控的各種損害性介質的表達；3)減輕肺實質細胞