脂多糖結(jié)合蛋白抑制肽對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的U937細(xì)胞和內(nèi)毒素血癥小鼠的作用及機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)毒素又稱脂多糖(LPS)，是革蘭陰性細(xì)菌外膜的主要成分。內(nèi)毒素血癥及與其有關(guān)的急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)是病人感染死亡的重要原因。脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)在炎癥中具有雙刃劍的作用，一方面，當(dāng)LBP的致炎位點(diǎn)與LPS的類脂A結(jié)合時(shí)，表現(xiàn)為信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，核轉(zhuǎn)錄因子激活，炎癥介質(zhì)生成，導(dǎo)致過激炎癥反應(yīng)發(fā)生；另一方面，當(dāng)LBP的抗炎位點(diǎn)與LPS的類脂A結(jié)合時(shí)，LBP將LPS傳遞給脂蛋

2、白或靶細(xì)胞，使LPS被中和或者被靶細(xì)胞清除，表現(xiàn)為抗炎作用。因?yàn)長(zhǎng)BP作用的雙重性，應(yīng)用LBP或抗LBP抗體治療內(nèi)毒素血癥均有一定的局限性，所以若僅阻斷LBP的致炎作用、保留其抗炎作用，則能提高內(nèi)毒素血癥的治療效果。我們實(shí)驗(yàn)室用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選獲得了可與LBP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LPS的噬菌體克隆，其核心序列與LBP的91～102位氨基酸(WKVRKSFFKLQG)有明顯同源性，推測(cè)該位點(diǎn)為L(zhǎng)BP的致炎位點(diǎn)。應(yīng)用FMOC固相法合成12肽WKV

3、RKSFFKLQG-NH2，即為L(zhǎng)BP抑制肽(簡(jiǎn)稱P12)。推測(cè)LBP抑制肽能與LBP的致炎位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LPS，從而起抗炎作用?；谏鲜黾僬f和以前的研究基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步就LBP抑制肽對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的U937細(xì)胞和內(nèi)毒素血癥小鼠的作用及機(jī)制進(jìn)行探討。 一、實(shí)驗(yàn)方法：本實(shí)驗(yàn)包括體內(nèi)和體外兩部分。 1.體外試驗(yàn)：以人單核巨噬細(xì)胞株U937細(xì)胞為研究對(duì)象。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，U937細(xì)胞被分為對(duì)照組、LPS組(分為100ng/ml的

4、小劑量組和1μg/ml的大劑量組)及P12組(分為小、中、大劑量組)。 (1)央心ELISA檢測(cè)P12與LPS的相對(duì)親和力。 (2)流式細(xì)胞檢測(cè)分析(FACS)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的LPS(FITC-LPS)與U937細(xì)胞的結(jié)合。 (3)RT-PCR和Westernblotting(WB)檢測(cè)U937細(xì)胞膜受體CD14和跨膜受體鐘形受體4(TLR4)mRNA和蛋白的表達(dá)。 (4)免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)和WB

5、聯(lián)合檢測(cè)定量反映核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)的活化程度。 (5)ELISA和硝酸還原酶法檢測(cè)U937細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的含量。 2.體內(nèi)試驗(yàn)：在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究P12對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、內(nèi)毒素血癥組及P12組。 (1)D-半乳糖致敏小鼠，LPS腹腔注射復(fù)制內(nèi)毒素血癥小鼠模型。 (2)支氣管肺泡灌洗分離肺泡巨

6、噬細(xì)胞(AMs)。 (3)肺組織切片，HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變。 (4)FACS檢測(cè)FITC-LPS與AMs的結(jié)合。 (5)免疫組織化學(xué)(IHC)和WB定量分析小鼠肺組織NF-κB的活化程度。 (6)ELISA和硝酸還原酶法檢測(cè)小鼠血漿中TNF-α和NO的含量。 (7)觀察P12對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠生存率的影響。 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.體外實(shí)驗(yàn)(1)在相同的質(zhì)量濃度下，P12與LPS的親合力比L

7、BP高，約為L(zhǎng)BP的1.15倍。 (2)P12抑制了FITC-LPS與U937細(xì)胞的結(jié)合，阻止了LPS的內(nèi)在化。 (3)RT-PCR和WB結(jié)果顯示：大劑量LPS(1μg/ml)與小劑量LPS(100ng/ml)相比所引起的CD14和TLR4的mRNA和蛋白的表達(dá)無明顯差異(P均＞0.05)；另外P12降低了LPS誘導(dǎo)的CD14和TLR4的mRNA和蛋白的表達(dá)。 (4)與CD14和TLR4的mRNA和蛋白的表達(dá)趨勢(shì)

8、不一致，大劑量LPS引起NF-κB的活化程度較小劑量LPS組明顯增加(P＜0.05)；P12抑制了小劑量LPS引起的NF-κB的活化，對(duì)大劑量LPS引起的NF-κB的活化無明顯抑制作用。 (5)與NF-κB活化趨勢(shì)一致，大劑量LPS引起TNF-α和NO的生成量較小劑量LPS組明顯增加(P均＜0.05)；P12能抑制小劑量LPS誘導(dǎo)的U937細(xì)胞TNF-α和NO的生成，但對(duì)大劑量LPS引起的TNF-α和NO的生成無明顯抑制作用。

9、 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(1)病理學(xué)結(jié)果顯示：P12顯著減輕了內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織的炎性反應(yīng)。 (2)P12明顯抑制了FITC-LPS與AMs的結(jié)合，減輕了LPS的內(nèi)在化。 (3)P12阻止了內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織NF-κB的活化；降低了小鼠血漿TNF-α及NO的含量。(4)P12降低了內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率。三、結(jié)論1.LBP抑制肽對(duì)小劑量LPS(100ng/ml)引起的過激炎癥反應(yīng)有抑制作用，并降低了內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率

10、。 2.其作用機(jī)制可能是LBP抑制肽阻止了LBP致炎信號(hào)的傳導(dǎo)。(1)LBP抑制肽通過與LBP的致炎位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LPS而抑制了LPS與單核巨噬細(xì)胞的結(jié)合，阻止了LPS的內(nèi)在化。 (2)LBP抑制肽通過下調(diào)LPS受體CD14和TLR4mRNA和蛋白的表達(dá)、減弱NF-κB的活化、減少TNF-α和NO的生成而抑制靶細(xì)胞的激活。3.LBP抑制肽對(duì)大劑量LPS(1μg/ml)引起的NF-κB活化及TNF-α和NO的生成無顯著抑制作