缺氧誘導因子-1α在紫外線誘導皮膚癌發(fā)生中的作用及其信號通路的研究.pdf

1、日光紫外線照射可引起急性損傷如日曬傷和慢性累積性損傷如皮膚癌及光老化。造成生物損害的紫外線主要是波長短，能量較高的UVB(290-320nm)。研究表明一些特別的信號分子調節(jié)這個轉化反應，包括表皮細胞生長因子受體(EGFR)，AP1，NFkB，P13激酶，和MAP激酶。這些受體活化和信號分子在光老化和皮膚癌基因表達變化中起著重要的作用。缺氧誘導因子(HIFl a)是HIF轉錄復合體成員之一。HIFl a近來被認為是改變不同類型癌癥基因表

2、達模式的一個因素，并且被認為是癌癥治療的一個有效的治療靶目標。在人類前列腺癌中通過EGFR/P13K/AKT途徑調控HIFl a表達。然而在紫外線誘導HIFl a表達中這個途逕是否參與仍不清楚。除了HIF外，其它兩個轉錄因子DECl和DEC2，近來被認為與HIF相互作用，參與細胞的增殖與存活。最近研究表明紫外線誘導HIFl a表達需要DECl，并且DECl的超表達給細胞提供了缺氧條件下不尋常的存活機制。在這個實驗設計中假設EGFR和P1

3、3K/AKT、調節(jié)紫外線誘導的HIFl a和它的基因表達。在紫外線照射過程中DECl和HIFl a相互調節(jié)。 研究目的： 1、研究UVB輻射誘導皮膚HaCaT細胞HIFl α及其目的基因VEGF、TFR表達a：不同劑量的UVB照射HaCaT細胞，在照射后不同的時間點收集細胞和上清，檢測HIFIα及其目的基因VEGF、TFR表達。 2、研究EGFR在UV誘導HaCaT細胞HIFl a及其目的基因VEGF、TFR表達

4、中的作用 a：加入EGFR抑制劑，觀察HIFl a及其目的基因VEGF、TFR表達是否會受到抑制 b：改變EGFR的表達(EGFR超表達、敲除EGFR基因)，觀察EGFR是否調節(jié)HIFl a及其目的基因VEGF、TFR的表達。 3、研究在UVB誘導HaCaT細胞HIFl a及其目的基因VEGF、TFR表達過程中，是否經過P13K/AKT途徑。 a：加入P13K激酶抑制因子觀察HIFl a及其目的基因VEG

5、F、TFR表達是否受到抑制。 4、研究在UVB輻射過程中DECl是否調節(jié)HIFla及其目的基因VEGF、TFR表達。 a：改變DECl的表達(DECl超表達、敲除基因)，觀察UVB輻射誘導HIFl a及其目的基因VEGF、TFR的表達過程中是否受DECl調節(jié)。 5、研究HIFlot對其目的基因VEGF、TFR的調節(jié)作用a：改變HIFl ct的表達(小RNA干擾)，觀察UVB輻射誘導VEGF、TFR的表達過程中是否

6、受HIFl a調節(jié)。 研究方法： 1．Western免疫印跡法檢測HIFl a。 2、流式細胞儀檢測EGFR、磷酸化EGFR和TFR的表達。 3．ELISA檢測上清中VEGF的水平。 4．realtime-PCR檢測HIF 1 a、VEGF及TFR mRNA表達。 5．利用Lemivectors慢病毒系統(tǒng)建立了針對HIFlα基因HaCaT(RNAi)穩(wěn)轉細胞株。 研究結果：

7、 1、不同劑量的UVB(0、1 0、20、30mJ/cm<'2>)輻射HaCaT細胞，在照射后6小時、12小時和24小時收集細胞檢測HIFl a及其目的基因VEGF、TFR蛋白表達，與未照射組相比，可發(fā)現紫外線可促進HIFl a及其目的基因VEGF、TFR蛋白表達，并呈劑量和時間依賴性。(P均)輻射HaCaT細胞，照射后4小時收集細胞，30mJ/cm<'2>UVB輻

8、射HaCaT細胞，在照射后l小時、2小時、4小時、8小時和16小時收集細胞，提取RNA，realtime-PCR檢測HIFl a、VEGF及TFR mRNA表達，結果發(fā)現，與未照射組相比，UVB不改變HIFl a mRNA(P均>0.05)，10 mJ/cm2就能明顯改變VEGF和TFRmRNA的表達(P

9、8小時達高峰。 2、30mJ/cm<'2>UVB照射HaCaT在照射后0、15min、30min、lh、2h、4h、8h收集細胞，流式細胞儀檢測EGFR和磷酸化EGFR的表達。結果發(fā)現紫外線照射后15min可以檢測到磷酸化EGFR的表達，30min時達最高峰，2h至8h降至基礎水平。在整個過程中EGFR的表達量不變。30mJ/cm<'2>UVB照射(EGFR+/-)、(EGFR+/+)：(EGFR-/-)NEE，照射后6、12、

10、24h收集細胞及上清，檢測HIFlα、TFR及VEGF的表達水平。HaCaT細胞在照射前1小時加不同濃度的EGFR抑制因子PD153035，照射后24小時收細胞及上清，檢測HIFlα、TFR及VEGF表達水平。 結果發(fā)現(EGFR+/+)MEF細胞組HIFla，VEGF表達明顯高于MEF(EGFR+/-)和(EGFR-/-)MEF細胞組(P均

11、顯(P均>0.05). PD153035，可明顯抑制HIFlα、TFR及VEGF表達，lum有抑制作用(P均<0.05)，5um抑制作用增強。 3、30mJ/cm<'2>紫外線照射HaCaT，PI3K抑制因子LY294002 0um、5um、20um，wortmanin Onm、500nm在照射前1小時不同的濃度加入，照射后12h收集細胞和上清。與未加抑制劑組相比，LY294002在5um有抑制作用(P均

12、制作用更強。wortmanin500nm對HIFlα、TFR及VEGF表達也有著較強的抑制作用(P均<0.05)。 4、30mJ/cm<'2>UVB照射(DECl+/-)、(DECl+/+)和(DECl-/-)HaCaT，照射后6、12、24h收集細胞及上清，檢測HIFα、TFR及VEGF的蛋白表達水平，結果發(fā)現，(DECI+\+)HaCaT細胞組HIFlα，VEGF表達明顯高于(DECI+/-)HaCaT和(DECl-/-)H

13、aCaT細胞組(P均<0.05)，(DECl-/-)HaCaT 細胞組UVB對HIFlα、VEGF促進作用明顯低于(DECl+/-)HaCaT組(P均<0.05)。30mJ/cm<'2>UVB輻射(DECI+/-)、(DECI+/+)和(DEC1-/-)HaCaT細胞，在照射后1小時、2小時、4小時、8小時和16小時收集細胞，提取RNA，realtime-PCR檢測HIFl a、VEGF及TFR mRNA表達。結果發(fā)現與(DECl+/-

14、)HaCaT組相比，(DECI+/+)HaCaT組VEGFmRNA在照射后16小時達高峰，且表達量增高。(DECl-/-)HaCaT細胞組隨時間的改變，VEGF mRNA表達變化不明顯(P>0.05)，表達量均低于(DECI+/-)HaCaT組(P均

15、RmRNA表達量均低于(DECl+/-)HaCaT組(P均UVB照射(SiRNAHIF1α)穩(wěn)定HaCaT細胞組和正常HaCaT細胞組，24小時收集細胞和上清檢測TFR和VEGF的蛋白表達。結果發(fā)現，與正常HaCaT細胞組比，(SiRNAHIFlα)穩(wěn)定HaCaT細胞組TFR和VEGF的蛋白表達量明顯降低(P均