Diallyl Disulfide對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)皮膚癌的預(yù)防作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　癌癥患者數(shù)量與日俱增，通過手術(shù)切除、放化療、甚至分子靶向抑制劑等單純的治療都無法完全根治癌癥，且醫(yī)療花費(fèi)巨大。癌癥等重大疾病的的預(yù)防一直是研究的重點(diǎn)。選擇低毒、經(jīng)濟(jì)且可長(zhǎng)期應(yīng)用的天然化合物預(yù)防癌癥的策略正逐步受到人們的重視。黑蒜是一種新型的大蒜加工食品，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎等許多生物學(xué)活性。黑蒜中的Diallyl Disulfide(DADS)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛能。本研

2、究在于考察DADS對(duì)于化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌體內(nèi)和體外模型的預(yù)防作用，并闡明其確切的作用機(jī)制。
　　內(nèi)容與結(jié)果：
　　本研究首先利用經(jīng)典的DMBA/TPA兩階段致癌模型及TPA誘導(dǎo)的JB6 P+細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分別在體內(nèi)外考察DADS的癌癥預(yù)防作用。結(jié)果表明預(yù)先給予DADS在體內(nèi)可以濃度依賴性地降低皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生率、平均荷瘤數(shù)目、腫瘤的大小以及在體外同樣可以濃度依賴性地減少TPA誘導(dǎo)的克隆形成數(shù)目。考慮到DADS具

3、有較強(qiáng)的抗氧化活性，通過檢測(cè)小鼠背部皮膚中活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)的水平，發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予DADS可以清除TPA誘導(dǎo)的高水平ROS含量，這主要與抗氧化酶活力的升高有關(guān)。采用Real-time PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DADS在體內(nèi)外模型中均可以濃度依賴性地提升抗氧化酶的mRNA水平。進(jìn)一步通過免疫組化和WesternBlot研究發(fā)現(xiàn)DADS可以在體內(nèi)外濃度依賴性地促進(jìn)小鼠皮膚細(xì)胞中的Nrf2入核。以上結(jié)果初

4、步表明DADS的癌癥預(yù)防作用與誘導(dǎo)Nrf2入核相關(guān)。選用Nrf2-/-小鼠進(jìn)行反向驗(yàn)證，結(jié)果表明DADS無法預(yù)防DMBA/TPA誘導(dǎo)的Nrf2-/-小鼠背部皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生與生長(zhǎng)以及無法減少DMBA/TPA誘導(dǎo)的小鼠背部皮膚增厚。由此證明了DADS是通過誘導(dǎo)Nrf2入核促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)增多發(fā)揮癌癥預(yù)防作用。利用細(xì)胞在體外探究DADS促進(jìn)Nrf2入核的具體機(jī)制，通過WesterBlot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)DADS可以時(shí)間依賴性地上調(diào)

5、Nrf2的核表達(dá)。其中，DADS作用4-8h時(shí)能顯著增加Nrf2的核內(nèi)表達(dá)。另外，通過給予p-Akt抑制劑MK2206反向驗(yàn)證，進(jìn)一步排除了DADS是通過激活MAPKs和Akt信號(hào)通路后引起Nrf2入核的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DADS能夠時(shí)間依賴地誘導(dǎo)Nrf2總蛋白表達(dá)水平升高，但不影響Nrf2的mRNA水平。選用蛋白酶抑制劑MG132與DADS合用，結(jié)果表明DADS與MG132協(xié)同抑制Nrf2降解。由此可知DADS是通過抑制Nrf

6、2的降解，從而引起了Nrf2的胞內(nèi)蓄積及后續(xù)的入核。為了探究DADS抑制Nrf2降解的機(jī)制，我們首先排除了DADS對(duì)Nrf2胞內(nèi)抑制因子Keap1的影響。而DADS能夠時(shí)間依賴地增加Nrf2的另一個(gè)結(jié)合蛋白p21的表達(dá)水平。而p21可以與Keap1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Nrf2，減少其降解。通過免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DADS不僅能促進(jìn)p21的表達(dá)，而且能夠促進(jìn)p21與Nrf2的結(jié)合，進(jìn)而減少了Nrf2的降解。此外，我們選用HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染p21

7、siRNA反向驗(yàn)證了p21在DADS調(diào)節(jié)Nrf2蛋白水平過程中的重要作用。
　　結(jié)論與意義：
　　基于以上結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)DADS成分可以預(yù)防化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的小鼠背部皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)。給予DADS能夠促進(jìn)p21與Nrf2結(jié)合增多，進(jìn)而減少了Nrf2的降解，增加了Nrf2的核表達(dá)并啟動(dòng)下游轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)上調(diào)，從而減少了ROS對(duì)機(jī)體的損傷，最終發(fā)揮了癌癥預(yù)防作用。該課題闡明了DADS具有很好的癌癥預(yù)防潛能并明確