腺病毒介導(dǎo)的HSV-TK-GCV系統(tǒng)對(duì)色素沉著絨毛結(jié)節(jié)滑膜炎滑膜細(xì)胞的殺傷作用.pdf

1、目的： 色素沉著絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎(pigmented villonodular synovitis，PVNS)是一種關(guān)節(jié)滑膜、滑囊和腱鞘的增殖性疾病，以滑膜高度增生、絨毛及結(jié)節(jié)形成和棕色含鐵血黃素沉著為其特點(diǎn)，對(duì)關(guān)節(jié)組織具有明顯的侵襲性，傳統(tǒng)治療方法包括手術(shù)治療和放療等療效差，易復(fù)發(fā)?；蛑委煟绕涫亲詺⒒虔煼ㄔ絹?lái)越多被應(yīng)用到臨床研究中，其中皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kin

2、ase，HSV-TK)基因轉(zhuǎn)染結(jié)合抗病毒藥更昔洛韋(Ganticlovir，GCV)是最常用的自殺基因系統(tǒng)之一。 本課題是利用自殺基因選擇性作用于增殖活躍細(xì)胞的機(jī)理，觀察腺病毒介導(dǎo)的HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)色素沉著絨毛結(jié)節(jié)滑膜炎增殖活躍的滑膜細(xì)胞的作用，探求HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)色素沉著絨毛結(jié)節(jié)滑膜炎的療效，以探索一條有效的基因治療途徑。 材料與方法 1.帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent

3、 protein，GFP)的重組腺病毒購(gòu)自本元正陽(yáng)公司，于我院中心實(shí)驗(yàn)室保存，Ad一TK滴度為3.2×1011pfu/ml。GCV購(gòu)自湖北科益藥業(yè)有限公司。 2.取色素沉著絨毛結(jié)節(jié)滑膜炎患者滑膜組織，按Goto方法分離并傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。取第三代滑膜細(xì)胞接種于24孔板，分別加入不同滴度的Ad-TK,第1孔加入PBS進(jìn)行空白對(duì)照，感染24h。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞百分率來(lái)測(cè)定細(xì)胞的感染效率，繪制感

4、染效率曲線。 3.取1×104個(gè)待測(cè)細(xì)胞，提取總的DNA，以HSV1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)HSV-tk的表達(dá)。 4 將第三代滑膜細(xì)胞接種于96孔板，以MOI為120的AD-TK轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞，并以未轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞作為對(duì)照，24小時(shí)后分別加入不同濃度的GCV(0.01、0.1、1、10和100 ug/mL)，48小時(shí)后MTT法檢測(cè)光吸收值，按以下公式測(cè)定細(xì)胞的存活率：存活率(％)=(實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×

5、100％，繪制存活率曲線。 5 用MOI為120的Ad-tk轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞，24h后，將轉(zhuǎn)染HSV-TK基因滑膜細(xì)胞(TK+細(xì)胞)與未轉(zhuǎn)染HSV-TK基因細(xì)胞(TK-細(xì)胞)分別以不同比例(0，10％，25％，50％，75％，100％)混合，接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，加入GCV10 μ g/ml的培養(yǎng)液，4d后，用MTT法計(jì)算細(xì)胞殺傷率，觀察旁觀者效應(yīng)。 6 用MOI為120的Ad-tk轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞，24h后加入10 μ

6、g/mlGCV，于12h、24h、48h分別置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；48h后用Hoechst33342/PI染色、固定，將細(xì)胞懸液滴在載玻片上，加蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)。 7 用MOI為120的Ad-tk轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞，24小時(shí)后加入GCV10μ g/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)，消化、離心、回收所有細(xì)胞，加入Annexin V FITC及PI，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。 結(jié)果： 1.滑膜細(xì)胞貼壁后，鏡下主要

7、可見兩種類型的細(xì)胞，即巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞(MCs)和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(FCs)。當(dāng)培養(yǎng)到第三代時(shí)，F(xiàn)Cs占較大比例。細(xì)胞呈梭形，增殖活躍。轉(zhuǎn)染腺病毒的滑膜細(xì)胞，表達(dá)GFP；MOI為120以上時(shí)，轉(zhuǎn)染率可達(dá)100％。 2.PCR產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠電泳顯示，Ad-tk轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞后，可見長(zhǎng)為1.13kb大小的特異性條帶，而對(duì)照組則未見相關(guān)條帶，表明HSV-TK基因已經(jīng)整合到基因組中。 3.Ad-tk/GCV系統(tǒng)對(duì)PVNS滑膜

8、細(xì)胞的殺傷作用：用MOI為120的Ad-tk轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞，加入不同濃度的GCV后，隨著GCV濃度的增加，細(xì)胞的存活率逐漸減少，GCV對(duì)轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性， 10 μg/ml GCV殺傷80％，而100ug/ml GCV對(duì)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞仍無(wú)明顯殺傷作用，說(shuō)明Ad-tk/GCV系統(tǒng)對(duì)滑膜細(xì)胞具有明顯的抑制作用。 4 轉(zhuǎn)染HSV-TK基因滑膜細(xì)胞(TK+細(xì)胞)與未轉(zhuǎn)染HSV-TK基因細(xì)胞(TK-細(xì)胞)分別以不同比例混合后，

9、加入10 μg/ml GCV，隨著TK+細(xì)胞比例的增加，存活率進(jìn)一步減低，當(dāng)TK+細(xì)胞占75％時(shí)，混合細(xì)胞幾乎全部死亡，表明該系統(tǒng)存在明顯的旁觀者效應(yīng)。 5 滑膜細(xì)胞經(jīng)HSV-TK/GCV系統(tǒng)作用后，倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡改變；24h后細(xì)胞開始萎縮，細(xì)胞核變得模糊不清；48h后部分細(xì)胞裂解為碎片。HSV-TK/GCV系統(tǒng)處理的滑膜細(xì)胞，用Hoechst33342/PI雙染色后有三種細(xì)胞狀態(tài)，分

10、別為：正常細(xì)胞藍(lán)色淡染，凋亡細(xì)胞為濃染或成顆粒狀，壞死細(xì)胞為紅色。 6 轉(zhuǎn)染HSV-TK基因的滑膜細(xì)胞，并給予GCV作用48小時(shí)后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的壞死和凋亡，壞死和凋亡比例分別為58.7％和23.4％，對(duì)照組無(wú)明顯的壞死和凋亡。 結(jié)論： 1.含HSV-TK基因的重組腺病毒載體對(duì)體外培養(yǎng)PVNS滑膜細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率。 2.HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)體外培養(yǎng)的色素沉著絨毛結(jié)節(jié)滑膜炎滑膜細(xì)胞具有抑制作用，