hTERT啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒介導(dǎo)的HSV-TK-GCV基因系統(tǒng)治療人膀胱癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤已經(jīng)成為人類(lèi)死亡的第一位或二位原因，而膀胱癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率最高的一種惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤發(fā)病率的第八位。膀胱癌最主要的特點(diǎn)就是容易復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)也很高，對(duì)于大多數(shù)中晚期腫瘤，尤其伴有局部擴(kuò)散或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，目前的治療方法還不能令人滿(mǎn)意，且浸潤(rùn)性膀胱癌的治療一直是個(gè)難題?；蛑委熡捎谀茚槍?duì)腫瘤組織內(nèi)特有的基因變異情況進(jìn)行修復(fù)或促使腫瘤細(xì)胞死亡，具有廣闊的應(yīng)用前景；特別是隨著一些高效而具有組織或細(xì)胞選擇性的給藥載體的成

2、功構(gòu)建、一些新的更具殺傷力的目的基因的發(fā)現(xiàn)，使基因治療可能在21世紀(jì)成為繼外科手術(shù)和放療、化療腫瘤治療的第四大常規(guī)手段。單純皰疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase，HSV-tk)基因其表達(dá)產(chǎn)物胸苷激酶能在靶細(xì)胞中將一般臨床的抗病毒藥物，如環(huán)氧鳥(niǎo)苷(gancyclovir,GCV)轉(zhuǎn)化成三磷酸產(chǎn)物，干擾靶細(xì)胞的DNA的合成過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而載體腺病毒(adenovirus，Ad)因具有轉(zhuǎn)

3、移率高、宿主廣泛的優(yōu)點(diǎn)尤其適合腫瘤基因治療。端粒酶是目前所見(jiàn)到的特異性較好的一種廣泛的腫瘤新標(biāo)志物。在90％以上的膀胱癌細(xì)胞中可檢測(cè)到其活性，而在絕大多數(shù)正常細(xì)胞無(wú)活性，這源于其核心成分——人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasetranscriptase，hTERT)基因的轉(zhuǎn)錄激活，它的表達(dá)調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平上，從而可以增強(qiáng)基因治療的靶向性和安全性。利用hTERT啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控病毒攜帶的目的基因，理論上可使病毒選擇性在端粒酶陽(yáng)性的腫

4、瘤細(xì)胞中表達(dá)目的基因。我們擬采用hTERT啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒介導(dǎo)的HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)，結(jié)合先天性缺乏胸腺的BALB/C裸鼠建立的人膀胱癌動(dòng)物模型，給予重組腺病毒尾靜脈注射治療，觀察其在體內(nèi)的治療效果、靶向性及安全性。 方法：裸鼠膀胱癌模型的建立和分組：在小鼠右前肢腋窩皮下接種253J膀胱癌細(xì)胞懸液，觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至直徑約為6mm時(shí)，對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，選用瘤體大小一致的裸鼠28只，分為4組，每組

5、7只。A組為Ad-hTERT-HSV-TK/GCV組；B組為Ad-hTERT-HSV-TK組；C組為GCV組；D組為對(duì)照組。Ad-hTERT-HSV-TK經(jīng)尾靜脈注射荷瘤小鼠，GCV腹腔注射治療。Ad-hTERT-HSV-TK/GCV治療后，觀察腫瘤體積、瘤重、腫瘤抑制率、腫瘤體積-時(shí)間曲線以及裸鼠生存期。通過(guò)常規(guī)病理切片觀察腫瘤破壞情況；通過(guò)TUNEL法、流式細(xì)胞學(xué)及透射電鏡進(jìn)一步觀察腫瘤的凋亡情況，免疫組化染色檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(P

6、CNA)，測(cè)定增殖指數(shù)。 結(jié)果：Ad-hTERT-HSV-TK/GCV治療組腹腔注射GCV后第7d，平均體積為286.43mm3±103.92mm3，明顯小于對(duì)照組499.77mm3±101.09mm3(p＜0.05)。直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，腫瘤體積都明顯小于Ad-hTERT-HSV-TK、GCV治療組和對(duì)照組。說(shuō)明腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組及Ad-hTERT-HSV-TK、GCV治療組。從移植瘤抑制率曲線可以看出，Ad-hTERT-H

7、SV-TK/GCV組比Ad-hTERT-HSV-TK、GCV單獨(dú)治療組能夠更明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步說(shuō)明了Ad-hTERT-HSV-TK/GCV對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；對(duì)切除腫瘤標(biāo)本的重量進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)Ad-hTERT-HSV-TK/GCV組的移植瘤重量明顯輕于對(duì)照組(P=0.0001＜0.05)，也輕于Ad-hTERT-HSV-TK、GCV治療組(P＜0.05)；Ad-hTERT-HSV-TK/GCV治療組與Ad-hTERT-

8、HSV-TK、GCV治療組及對(duì)照組相比，可以明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。病理檢查發(fā)現(xiàn)，治療組腫瘤細(xì)胞呈稀疏分散排列，有片狀壞死，腫瘤血管明顯減少，組織結(jié)構(gòu)紊亂，多為纖維組織所代替，部分胞漿空泡性變，胞漿淡染，染色質(zhì)疏松，部分腫瘤細(xì)胞核固縮，呈退化表現(xiàn)。Ad-hTERT-HSV-TK/GCV治療后，心、肺、肝、腦、腎、脾組織形態(tài)學(xué)觀察，與正常對(duì)照形態(tài)學(xué)上無(wú)顯著區(qū)別。流式細(xì)胞技術(shù)及TUNEL法測(cè)定該系統(tǒng)所致的凋亡率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05

9、)，透射電鏡檢查可明顯檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞凋亡，另外通過(guò)免疫組化法測(cè)定核增值抗原所得的增殖指數(shù)可以看出Ad-hTERT-HSV-TK/GCV組明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。 結(jié)論：Ad-hTERT-HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)有明顯抑制作用；向膀胱癌細(xì)胞選擇性地導(dǎo)入以hTERT作為啟動(dòng)子腺病毒載體介導(dǎo)的HSV-TK基因增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性，使HSV-TK基因準(zhǔn)確導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，不侵犯正常細(xì)胞，從而增加治療的靶向