rAAV2介導的HSV-TK-GCV系統(tǒng)對晶狀體上皮細胞抑制作用的研究.pdf

1、第一章腺相關病毒介導增強型綠色熒光蛋白基因在晶狀體上皮細胞中的轉染和表達 目的：研究2型重組腺相關病毒(rAAV2)載體介導增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)在體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細胞(N/N1003A)67的表達，以及病毒載體轉染對晶狀體上皮細胞增殖的影響，為rAAV2攜帶治療基因防治后囊膜混濁提供理論依據(jù)。 方法：rAAV2-EGFP按感染復數(shù)(MOI)為10<'4>、10<'5>、2×10<'6>、10<'6>轉染

2、N/N1003A細胞，相差顯微鏡觀察rAAV-EGFP轉染對細胞生長和形態(tài)的影響；轉染后每天在倒置熒光顯微鏡下觀察晶狀體上皮細胞中EGFP的表達，于轉染后1、3、5、7、9d，記錄200個細胞中EGFP陽性表達所占的百分比；當EGFP表達穩(wěn)定后激光共聚焦顯微鏡照相。轉染后第2、7d流式細胞儀檢測rAAV2-EGFP對N/N1003A細胞的轉染效率。MTT比色法測定rAAV2-EGFP對N/N1003A細胞增殖的影響。 結論：重組

3、腺相關病毒載體可以介導增強型綠色熒光蛋白基因穩(wěn)定轉染晶狀體上皮細胞，并且轉染效率高，腺相關病毒是后囊膜混濁基因治療的良好載體。 第二章攜帶HSV-TK基因的重組AAV載體的構建及表達 目的：構建含有單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重組腺相關病毒載體質粒pSNAV2.0-TK，制備重組腺相關病毒rAAV2/HSV-TK，并檢測轉染TK基因后晶狀體上皮細胞細胞中的整合和表達，為后囊膜混濁的基因治療奠定基礎。

4、 方法：用SalI+EcoRI酶將TK基因從質粒pDC316-TK切出，連接到質粒pSNAV2.0中，構建成重組質粒pSNAV2.0-TK，分別甩PCR和上述內切酶鑒定重組質粒；以該質粒轉染BHK-21細胞，在G418壓力下篩選得到攜帶載體質粒pSNAV2.0-TK的載體細胞株，并在輔助病毒HSV1-rc/△UL2的參與下包裝重組病毒rAAV2/HSV-TK； SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法和高效液相色譜(HPLC)法

5、檢測rAAV2/HSV-TK的純度；用DNA斑點雜交方法檢測純化的rAAV2/HSV-TK的滴度；重組病毒rAAV2/HSV-TK轉染N/N1003A細胞，用PCR和RT-PCR分別檢測TK基因的整合和表達。 結論：成功構建了攜帶TK基因的重組載體質粒pSNAV2.0-TK，制備了高純度、高滴度的重組腺相關病毒rAAV2/HSV-TK；轉導重組病毒rAAV2/HSV-TK的晶狀體上皮細胞中有TK基因的整合和有效表達。 第

6、三章重組腺相關病毒介導HSV-TK/GCV系統(tǒng)對晶狀體上皮細胞的作用 目的：觀察2型重組腺相關病毒(rAAV2)載體介導的單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因/丙氧鳥苷(GCV)系統(tǒng)對體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細胞的殺傷效應，并初步探討晶狀體上皮細胞死亡的機制。 方法：利用攜帶HSV-TK基因的2型重組腺相關病毒(rAAV2)載體rAAV2/HSV-TK感染體外培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細胞N/N1003A，聯(lián)合使用GCV治療，以

7、沒有轉染重組病毒的細胞作為對照，MTT法觀察不同濃度GCV和作用時間對細胞存活率的影響；分別將轉染了HSV-TK基因的N/N1003A-TK細胞與正常N/N1003A細胞按不同比例混合培養(yǎng)，觀察HSV-TK/GCV系統(tǒng)的旁觀者效應；以不同感染復數(shù)(MOI)的重組病毒rAAV2/HSV-TK轉染N/N1003A細胞，觀察MOI對HSV-TK/GCV系統(tǒng)殺傷效應的影響。應用透射電鏡觀察、Hoechst33258染色等方法觀察細胞凋亡、壞死改