腺病毒介導(dǎo)的自殺基因HSV-TK-GCV系統(tǒng)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎增殖滑膜細(xì)胞的作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性骨關(guān)節(jié)病，滑膜的炎性增生反應(yīng)是關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞的重要參與者，促進(jìn)了OA的病程進(jìn)展。OA發(fā)生時(shí)滑膜增生，超微結(jié)構(gòu)觀察呈現(xiàn)功能活躍相。OA嚴(yán)重危害老年人健康，是長期喪失勞動(dòng)力的重要原因之一。但至今對(duì)OA的治療效果和方便程度無法令人滿意?；蛑委烵A的研究也在進(jìn)行中，促進(jìn)了對(duì)OA的治療。本課題是利用自殺基因選擇性作用于增殖活躍細(xì)胞的機(jī)理，觀察腺病毒介導(dǎo)的單純皰疹病毒-胸苷激酶

2、(herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)基因/丙氧鳥苷(ganciclovir,GCV)系統(tǒng)對(duì)OA增殖活躍的滑膜細(xì)胞的作用，初步研究其在OA基因治療中的應(yīng)用。 材料和方法 1、帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重組腺病毒于我院中心實(shí)驗(yàn)室保存，重組腺病毒Ad CMV HSV-TK的擴(kuò)增、純化及滴度測(cè)定均由我院實(shí)驗(yàn)室完成，Ad-

3、TK的病毒效價(jià)為1×10<'12>。 2、取OA患者行膝關(guān)節(jié)置換時(shí)切下的滑膜組織，按Goto方法分離并傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。取第三代滑膜細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板上，分別加入不同滴度的Ad-TK，第1孔加入PBS進(jìn)行空白對(duì)照，感染24h。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞百分率來測(cè)定細(xì)胞的感染效率，繪制感染效率曲線。 3、滑膜細(xì)胞接種于96孔板上，加入100moi的病毒液感染24h，以未感染的細(xì)胞作為對(duì)照。

4、分別加入不同濃度的GCV。48h后加入MTT，4h后測(cè)定各孔的吸光值(A)。計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100﹪。將感染100moi病毒的滑膜細(xì)胞按所占比例分別為20﹪、40﹪、60﹪、80﹪同未感染的細(xì)胞混合24 h接種于96孔板上，以未感染的細(xì)胞作為對(duì)照。加入10mg/l的GCV 48h。MTT法測(cè)吸光值計(jì)算細(xì)胞抑制率。 4、100 moi的Ad．TK感染滑膜細(xì)胞24h后，給予10mg/l GCV，

5、于0、12、24、48h分別置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；100moi的Ad-TK感染滑膜細(xì)胞24h后，給予10mg/lGCV，48h后用Hoechst33342/PI染色、固定，將細(xì)胞懸液滴在載玻片上，加蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)。 5、100 moi的Ad-TK感染滑膜細(xì)胞24h后，給予10mg/lGCV48h后消化、離心、回收所有細(xì)胞，加入Annexin V-FITC、PI；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。 結(jié)果

6、 1、滑膜細(xì)胞貼壁后，鏡下可見三種類型的細(xì)胞，即樹突樣細(xì)胞(DCs)、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞(MCs)和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(FCs)，以FCs成分為主。當(dāng)培養(yǎng)到第三代時(shí)，形成較為均一的FCs。細(xì)胞呈梭形，增殖活躍。轉(zhuǎn)染腺病毒的滑膜細(xì)胞表達(dá)GFP；當(dāng)腺病毒濃度為100moi以上時(shí)，有100﹪的滑膜細(xì)胞感染。 2、MTT法測(cè)定滑膜細(xì)胞抑制率：細(xì)胞只加入Ad-TK或GCV，生長未受抑制；100moi Ad-TK轉(zhuǎn)染組細(xì)胞加入GCV后，細(xì)胞生長受

7、抑制，并隨GCV濃度增大細(xì)胞抑制率增大，當(dāng)加入10 mg/l GCV后，細(xì)胞抑制率為76.0﹪。將細(xì)胞混合培養(yǎng)，加入10 mg/l GCV 48h后，當(dāng)感染細(xì)胞占20﹪時(shí)，細(xì)胞抑制率為對(duì)照組的31.2﹪；細(xì)胞抑制率高于不混合時(shí)的抑制率。 3、滑膜細(xì)胞經(jīng)HSV-TK/GCV系統(tǒng)作用后，倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡改變，細(xì)胞核變大；24h后細(xì)胞進(jìn)一步腫脹變大，胞漿內(nèi)空泡增多，細(xì)胞核變得模糊不清；48h后

8、部分細(xì)胞裂解為碎片。HSV-TK/GCv系統(tǒng)處理的滑膜細(xì)胞，用}toechst 33342/PI雙染色后有3種細(xì)胞狀態(tài)，分別為：正常細(xì)胞藍(lán)色淡染，凋亡細(xì)胞為濃染或成顆粒狀，壞死細(xì)胞為紅色。 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染TK基因并給予GCV后48 h，細(xì)胞出現(xiàn)較大比例的壞死和凋亡，壞死和凋亡比例分別為59.1﹪、13.4﹪，對(duì)照組無明顯壞死和凋亡。 結(jié)論： 1、OA滑膜細(xì)胞取材方便，易于體外培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增；攜帶GFP的腺

9、病毒載體可以高效感染體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞。 2、HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)體外OA滑膜細(xì)胞有抑制作用，在一定范圍內(nèi)GCV有濃度依賴性；HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)體外OA滑膜細(xì)胞存在"旁觀者效應(yīng)"。 3、細(xì)胞經(jīng)HSV-TK/GCV系統(tǒng)作用后形態(tài)學(xué)發(fā)生變化：細(xì)胞變形、結(jié)構(gòu)改變，最后死亡；雙染色后熒光顯微鏡見細(xì)胞有壞死和凋亡。 4、流式細(xì)胞儀證實(shí)HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)體外OA滑膜細(xì)胞有明顯抑制作用，壞死率高于凋亡率。