人CR1功能域SCR15-18在畢赤酵母中的表達(dá)及其對(duì)腸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、腸缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常見(jiàn)的組織器官損傷之一，在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、心肺功能不全等疾患的病理演變過(guò)程中起重要作用，死亡率高。腸I/R損傷是多種因素作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜。近年來(lái)的研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度活化在腸I/R損傷的發(fā)生與展中起著十分重要的作用，抑制補(bǔ)體活化已成為防治腸缺血再灌注損傷的重要策略。 在缺血再灌注損傷等補(bǔ)體過(guò)度活化的疾病中，壞死的組織細(xì)

2、胞、MBL復(fù)合物、暴露的抗原和線粒體等通過(guò)經(jīng)典、旁路和MBL三個(gè)補(bǔ)體途徑共同激活補(bǔ)體。同時(shí)，補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3a、C5a和C5b-9均參與了組織損傷過(guò)程，出現(xiàn)惡性循環(huán)。因此，單一的從某一條途徑或某一活化產(chǎn)物阻斷補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷是不夠的。在三條補(bǔ)體激活途徑中，雖然活化起始點(diǎn)不同，但都在C3處匯合，通過(guò)C3轉(zhuǎn)化酶裂解C3，繼而形成C5轉(zhuǎn)化酶，裂解C5，活化補(bǔ)體形成攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)，因此C3/C

3、5轉(zhuǎn)化酶是理想的抑制靶點(diǎn)。補(bǔ)體受體1型(complement receptor type1，CRl)是由30個(gè)短同源重復(fù)序列( short consensus repeats，SCR)構(gòu)成的補(bǔ)體抑制因子，是體內(nèi)唯一的既對(duì)經(jīng)典、旁路、MBL三個(gè)補(bǔ)體激活途徑的C3/C5轉(zhuǎn)化酶有加速衰變作用，又有輔助I因子裂解C3b/C4b作用的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白。其中SCR15-18，能結(jié)合C3b/C4b，阻礙C3/C5轉(zhuǎn)化酶的形成，輔助I因子裂解C3b/C4b

4、，進(jìn)而抑制C3/C5轉(zhuǎn)化酶，阻斷和抑制C5a及C5b-9等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，具有抗補(bǔ)體治療的潛在應(yīng)用價(jià)值。 本研究在我室前期工作的基礎(chǔ)上構(gòu)建CR1-SCR15-18的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤酵母中誘導(dǎo)分泌表達(dá)目的蛋白CR1-SCR15-18，用Ni2+-NTA樹(shù)脂親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物，并觀察目的蛋白CR1-SCR15-18在體外抑制補(bǔ)體溶血的活性以及在體內(nèi)對(duì)急性腸I/R損傷的保護(hù)作用。研究取得了以下主要結(jié)果： 1.根據(jù)人C

5、R1-SCR15-18 DNA序列和pPIC9的多克隆酶切位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在上游引物(Pl)通過(guò)XholI酶切位點(diǎn)把目的片段連在信號(hào)肽序列的后面，下游引物(P2)加入TAG終止密碼、6X HIS標(biāo)簽和Not I酶切位點(diǎn)。以pET32a-sCR1-SCR15-18重組質(zhì)粒為模板，成功擴(kuò)增了CR1-SCR15-18 DNA片段，片段大小為756 bp。 2.將PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段和pPIC9質(zhì)粒經(jīng)Xhol I+Not

6、I雙酶切，膠回收后，兩者按一定比例用T4連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定正確，命名為pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI線性化pPIC9-CR1-SCR15-18，膠回收后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(MD平板)篩選重組酵母菌。經(jīng)PCR鑒定確認(rèn)，成功篩選到4個(gè)陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子，命名為pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌

7、落接種BMGY增菌，換BMMY后在搖瓶水平經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westem blot證實(shí)，目的基因在畢赤酵母中成功分泌表達(dá)。 5.CRl-SCR15-18蛋白經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后，基本無(wú)雜蛋白存在，表明采用親和層析可實(shí)現(xiàn)CR1-SCR15-18蛋白的一步快速純化。純化干燥后稱重，蛋白最終得率為31.8mg/L，為高密度發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。 6.體外生物活性分析顯示，目的蛋白具有抑制補(bǔ)體溶血的活性

8、，隨著蛋白濃度的降低，抑制補(bǔ)體溶血的能力隨之減弱，目的蛋白抑制補(bǔ)體溶血的活性有量效關(guān)系。表明我們制備的重組蛋白在體外有抑制補(bǔ)體活性的功能。 7.成功建立大鼠急性腸I/R動(dòng)物模型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：I/R組的結(jié)果與假手術(shù)組的相比，血管通透性增加，MPO活性和MDA含量顯著升高，而SOD活性降低，腸組織原位有大量的補(bǔ)體C3組分沉積，病理?yè)p傷嚴(yán)重，腸黏膜頂端上皮大片壞死，脫落，大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、黏膜固有層水腫、瘀血、細(xì)胞構(gòu)成增多；與I/R

9、組相比，CR1保護(hù)組腸血管通透性顯著降低，MPO活性和MDA含量顯著降低，而SOD活性升高，腸粘膜組織原位僅有少量補(bǔ)體C3組分的沉積，病理?yè)p傷顯著減輕。 綜上所述：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CR1-SCR15-18的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤酵母中分泌表達(dá)了CR1-SCR15-18蛋白，并證實(shí)純化后的CR1-SCR15-18蛋白在體外有抑制補(bǔ)體活性的功能，在體內(nèi)對(duì)大鼠急性腸I/R損傷有抗炎保護(hù)作用。為進(jìn)一步研究補(bǔ)體介導(dǎo)的缺血再灌注損傷、異種