牛磺酸對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞谷氨酸興奮毒性的防護(hù)及機(jī)制研究.pdf

1、谷氨酸(glutamate,Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)遞質(zhì),它介導(dǎo)興奮性突觸傳遞.但突觸間過量的Glu會引起神經(jīng)元損傷甚至死亡,稱為Glu的興奮毒性.大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示,Glu的興奮毒性在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血、創(chuàng)傷及神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)元死亡中起著重要作用.現(xiàn)已明確,Glu的興奮毒性是Glu在突觸間的過量釋放及對突觸后神經(jīng)元的進(jìn)一步激活.其作用機(jī)制為:過量釋放的Glu激活突觸后膜上大量的谷氨酸受體,引起相應(yīng)的離子通道開放,影響Na<'+

2、>、Cl<'->、Ca<'2+>等的跨膜流動,主要導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度升高(稱為細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>超載),過量的Ca<'2+>激活細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>依賴的信號級聯(lián)途徑,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡.其中,細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>超載是Glu興奮毒性引起神經(jīng)細(xì)胞死亡的中心環(huán)節(jié).Glu增加細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>主要是通過以下幾種機(jī)制機(jī)制:①激活可透過Ca<'2+>的離子型NMDA受體通道;②激活離子型AMPA受體引起膜去極化從而開放電壓依賴的

3、Ca<'2+>通道;③激活代謝型谷氨酸受體導(dǎo)致其耦聯(lián)的磷酸肌醇水解,后者使Ca<'2+>從細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放.基于以上分析,結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展,該課題通過體內(nèi)和體外研究觀察?；撬釋lu引起的RGCs興奮毒性的防護(hù)作用.體內(nèi)研究通過在大鼠玻璃體內(nèi)注射Glu造成視網(wǎng)膜Glu興奮毒性的動物模型,通過視網(wǎng)膜全鋪片RGCs計(jì)數(shù)、視網(wǎng)膜電圖(Electroretinograms,ERG)、視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)觀察等方法觀察牛磺酸對大鼠視網(wǎng)膜Glu

4、興奮毒性的體內(nèi)防護(hù)作用;并運(yùn)用原位TUNEL檢測、免疫組化、免疫印跡、RT-PCR等技術(shù),進(jìn)一步觀察?；撬釋lu所致的視網(wǎng)膜RGCs凋亡、視網(wǎng)膜Glu、Thy-1、神經(jīng)絲蛋白輕鏈(neurofilaments light chain,NF-L)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein,GFAP)蛋白及mRNA的表達(dá)水平改變的影響.體外研究采用兩種細(xì)胞模型:原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元及原代純化

5、培養(yǎng)的大鼠RGCs,分別以終濃度為1mmol/L的Glu作用于原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞10min、25μmol/L Glu作用于RGCs 3天制備Glu興奮毒性模型.通過臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)、鈣黃綠素-AM染色存活細(xì)胞、TUNEL檢測、Thy-1蛋白表達(dá)檢測等技術(shù)觀察牛磺酸對培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、純化培養(yǎng)的RGCs Glu興奮毒性的防護(hù)效應(yīng);利用激光共聚焦Ca<'2+>成像技術(shù),觀察?；撬釋lu引起的培養(yǎng)RGCs細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>([Ca<