BM-EPCs促進兔急性缺血后肢血管生成的實驗研究.pdf

1、自從1997年Asahara報道了內(nèi)皮祖細胞（EPCs）參與生后的血管發(fā)生、血管形成、構成血管內(nèi)皮和形成新的血管以來，其對缺血心肌血管生成效應已被許多實驗所證實。EPCs對缺血下肢的血管生成效應與之相似，但研究較少。近年來這種理論也受到了挑戰(zhàn)，有人認為EPCs，尤其是由骨髓培養(yǎng)得到的EPCs（BM-EPCs）本身并不參與血管內(nèi)皮的形成，而是通過自身的自分泌或旁分泌VEGF，HGF，G-CSF等細胞因子，趨化內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞形成新的血

2、管。本實驗設計采用自體移植來控制免疫反應對實驗的影響，通過EPCs相對無限自我更新和克隆的特性擴增其數(shù)量，以期明確是否骨髓單核細胞誘導而來的EPCs直接參與血管生成，并明顯促進兔缺血后肢新血管生成。為EPCs治療下肢缺血更好地應用于臨床積累依據(jù)。 目的： 由兔骨髓單核細胞誘導培養(yǎng)BM-EPCs，將其移植到切除股動脈的缺血后肢，通過對照觀察明確1.是否BM-EPCs自身直接參與新生血管內(nèi)皮的生成；2.BM-EPCs移植是否

3、能在兩周之內(nèi)明顯促進兔缺血后肢的血管生成。 方法和材料： 將24只新西蘭白兔隨機數(shù)字法分成實驗組和對照組，在3%戊巴比妥鈉全麻下（30-45mg/kg），結扎并切斷左側股總動脈近端及遠端將分出胭動脈和隱動脈處，結扎并切斷其間的包括股深動脈的所有可見分支。將此段血管游離丟棄，建成缺血模型。從右后肢脛骨上端以下1cm處穿刺髓腔抽取4ml骨髓，密度梯度離心法分離出單核細胞，EBM-2培養(yǎng)基添加VEGF、bFGF、IGF等因子誘

4、導，貼壁篩選法選擇培養(yǎng)BM-EPCs，與熒光偶聯(lián)的AC-LDL、UEA-1結合，熒光顯微鏡鑒定。培養(yǎng)第10天，缺血模型建立后第7天計數(shù)并肌內(nèi)移植到對應兔的缺血后肢，移植前一天將細胞與10umol/lBrdu共孵24h，將BM-EPCs標記，對照組注射相同體積的培養(yǎng)基。移植后7天分別隨機從對照組和實驗組用過量麻醉犧牲6只兔，取其內(nèi)收肌標本，固定，分別用CD31、Brdu抗體標記毛細血管和BM-EPCs，計數(shù)毛細血管的數(shù)量，觀察EPCs的位

5、置；在14天同法犧牲余下的處理組6只兔和對照組的6只兔，同法免疫染色，計數(shù)毛細血管的數(shù)量，觀察EPCs的位置。 結果： 1.通過直視下手術的方法，找到了約Ф1.2mm，Ф0.7mm的髂外動脈和股深動脈及可見的腹壁淺動脈、腹壁下動脈、側旋支、胭動脈和隱動脈（見圖1），進行了髂外分出處以遠0.5cm到股動脈分出胭動脈和隱動脈處近端0.5cm處約2.5cm長的整段切除，完成了模型制作。術后所有動物立即出現(xiàn)了左后肢跛行，術后一周

6、與健側后肢相比均出現(xiàn)肌萎縮，1只出現(xiàn)皮膚干性潰瘍。 圖1家兔股部主要血管示意圖引自第一部分參考文獻[1] 2.選用密度為1.0965±0.001g／cm3的兔淋巴細胞分離液，對動物骨髓進行了密度梯度離心，離心后看到了白膜狀分層標志，從兔股骨骨髓中分離到了單核細胞，用含有VEGF、bFGF、IGF和5%FBS的EGM-2培養(yǎng)基，結合貼壁篩選法，誘導出了針形的、可成集落的、呈線狀網(wǎng)狀生長的ac-LDL和UEA-1雙結合試驗陽

7、性的BM-EPCs。 3.在實驗組家兔后肢內(nèi)收肌橫切標本中的毛細血管內(nèi)皮中觀察到了Brdu標記的EPCs。細胞移植后7天，實驗組和對照組標本每高倍視野的毛細血管數(shù)和毛細血管數(shù)/肌纖維比率分別為（x±sd n=6，下同）4.19±1.10和2.47±1.08，P=0.021；0.86±0.38和0.38±0.08，P=0.027。細胞移植后的14天實驗組和對照組標本的以上兩個指標分別為5.39±1.58和2.10±1.05，P=0