CXCR4過表達(dá)HUCB-late EPCs移植對后肢缺血組織血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 rAAV1-9對人臍帶血晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的研究
　　目的:
　　觀察rAAV1-9對人臍帶血晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞（HUCB-late EPCs）的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，篩選合適的重組腺相關(guān)病毒血清型作為攜帶CXCR4基因的載體。
　　方法:
　　1.用PEI介導(dǎo)表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的rAAV包裝系統(tǒng)(pAAV-CMV-GFP，pAAV-RC1-9和pHelper)

2、轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞分離獲得不同血清型表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的rAAV-GFP，濃縮純化病毒，以SDS-PAGE法檢測病毒純度和qPCR法測定病毒滴度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高的重組腺相關(guān)病毒血清型作為攜帶CXCR4基因的載體，以同樣的方法獲取rAAV-CXCR4;
　　2.密度梯度離心法分離臍帶血單個核細(xì)胞(MNCs)，將其誘導(dǎo)培養(yǎng)為EPCs，連續(xù)培養(yǎng)4周獲得晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(late endothelial proge

3、nitor cellslate EPCs);
　　3.將late EPCs種植到24孔板中（每孔1×104個），加入濃縮、純化后的重組腺相關(guān)病毒（rAAV1至rAAV9），感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infectionMOI)為100，000 viral genomes/cell，每種血清型病毒重復(fù)3次;用ImagePro Plus6.0圖像分析軟件計算不同感染時間(6h，12h，18h，24h，30h，36 h)表

4、達(dá)GFP的EPCs比例，計算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的rAAV血清型（rAAV1-9-GFP），經(jīng)純化濃縮后病毒的滴度均超過2.0×109vg/μl，rAAV6-CXCR4的滴度為2.88×109vg/μ l。
　　2.人臍帶血單個核細(xì)胞(MNCs)經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后，經(jīng)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)記及生物學(xué)特征鑒定為late EPCs。
　　3.rAAV1-9對Late EPC

5、s的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率存在明顯差異，rAAV6的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高(0.5208±0.0147)，rMV2次之(0.4506±0.011)，rMV4的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最低(0.1382±0.0102),P＜0.05。
　　第二部分 CXCR4基因過表達(dá)HUCB-late EPCs移植對大鼠后肢缺血組織血管新生的影響
　　目的:
　　1.觀察轉(zhuǎn)染rAAV6-CXCR4和rAAV6-GFP后，HUCB-late EPCs的體外成血管能力。

6、　　2.觀察CXCR4基因過表達(dá)HUCB-late EPCs移植對大鼠后肢缺血組織血管新生的影響。
　　方法:
　　1.用rAAV6-CXCR4、rAAV6-GFP感染人臍帶血late EPCs，Western Blot檢測CXCR4蛋白表達(dá)水平。
　　2.設(shè)立rAAV6-CXCR4感染組、rAAV6-GFP感染組和空白組，應(yīng)用基質(zhì)膠成血管實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體外成血管能力。
　　3.構(gòu)建SD大鼠后肢缺血模型。6

7、周齡雄性SD大鼠18只，SD大鼠稱重后，腹腔注射10％水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉。以一側(cè)股動脈及分支結(jié)扎、離斷的方法構(gòu)建后肢缺血模型。
　　4.隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組缺血后肢肌內(nèi)直接注射500μ l含1×106個CXCR4過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞的EGM-2、對照組缺血后肢肌內(nèi)直接注射500μl含1×106個內(nèi)皮祖細(xì)胞的EGM-2、空白對照組缺血后肢肌內(nèi)直接注射500μ lEGM-2。28天后，脫頸法處死

8、動物，立即取缺血后肢腓腸肌，放入10倍體積的4％多聚甲醛固定。
　　5.HE染色檢測缺血后肢肌肉間、肌肉旁微小血管情況;免疫組織化學(xué)染色檢測肌肉間、肌肉旁新生血管CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)情況，并計算CD31陽性新生微血管數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1.rAAV6-CXCR4感染組HUCB-late EPCs中CXCR4蛋白的表達(dá)高于rAAV6-GFP感染組和對照組。
　　2.3組均在基質(zhì)膠上成功形成管腔樣結(jié)構(gòu)，單位

9、面積基質(zhì)膠形成的管腔面積分別為0.531±0.023mm2、0.514±0.026mm2、0.523±0.021mm2.，rAAV6-CXCR4、rAAV6-GFP感染對late EPCs的體外成血管能力無影響（P＞0.05）。
　　3.與空白組比較對照組和實(shí)驗(yàn)組CD31+表達(dá)的新生微血管明顯增多，實(shí)驗(yàn)組新生微血管表達(dá)數(shù)量較對照組多（P＜0.05），分別為:肌肉間(2.32±0.90、5.18±0.86、8.39±0.91);肌肉