新鮮分離的脂肪血管基質片段細胞促進兔脂肪移植存活的實驗研究.pdf

1、臨床上因先天性畸形、外傷及腫瘤切除術等各種原因所造成的軟組織缺損的修復是整形修復外科面臨的重大難題之一。自體游離脂肪移植，自Neuber于1893年首先報道用以填充切除瘢痕后的缺損以來，已有100多年的歷史。相對于其他軟組織充填法而言，脂肪移植具有許多潛在的優(yōu)點：來源豐富，易于獲取，無免疫原性，并且有良好的物理特性。 然而，脂肪移植物的低存活率及其體積存留的不可預知性，限制了其臨床應用。移植物的存活期差異極大，且大塊移植物的體積

2、隨著時間延長會顯著減小。組織學檢測顯示移植的脂肪細胞進行性減少，移植物逐漸被纖維組織替代，且通常伴有囊泡形成。研究表明，初期移植物只能靠周圍組織液的浸潤和滲透來維持營養(yǎng)供應，而宿主的新生血管長入移植物一般要在移植后5天并且只能侵入移植物的周邊部位，移植物中央部分的組織因缺血而壞死。因此臨床?？s小脂肪移植物的體積，以利于周圍營養(yǎng)物質的彌散及利用，直至新生血管形成。 顯然，移植物早期建立及時而充分的血供，是提高其存活率的關鍵。近年來

3、人們發(fā)現干細胞可促進新生血管形成以及抑制炎癥反應，展示了干細胞在脂肪移植應用中的美好前景。但應用胚胎干細胞，會帶來倫理學的困擾，且細胞的生物學特性，如致腫瘤性及自發(fā)畸胎瘤形成等限制了其在非致命性疾病的治療。骨髓間充質干細胞作為可再生的成體干細胞，具有成骨、成軟骨等多向分化能力，然而可收集的細胞數量少，需體外擴增，取材伴隨的并發(fā)癥等也不利于臨床推廣。 脂肪來源干細胞（ASCs）可自切取的以及抽吸的脂肪中均能分離獲取。研究表明，形態(tài)

4、類似成纖維細胞的ASCs，與骨髓干細胞一樣，在體外具有向脂肪、骨、軟骨、神經、心肌、平滑肌及骨骼肌等多個譜系分化的能力。值得一提的是ASCs可分化為血管內皮細胞，且在缺氧環(huán)境下可分泌促進血管形成的細胞因子，從而促進脂肪移植后的血管化進程。 本課題組前期的研究發(fā)現，體外培養(yǎng)的人ASCs混合脂肪顆粒移植于裸鼠皮下，促進新生血管形成，顯著提高脂肪移植物的存活率。然而，體外培養(yǎng)獲取自體ASCs顯然無法完全滿足臨床需要。體外擴增最少需要2

5、-3周的時間，這就意味者接受脂肪移植的患者需要二期手術。不僅如此，體外培養(yǎng)操作繁瑣，易污染，安全性低。 因此，如何安全、方便的獲取足夠數量的、具有生物學效應的ASCs，是其應用于脂肪移植臨床的關鍵。若能建立“脂肪干細胞庫”，可隨時獲取同種異體來源的ASCs，移植則可一期完成，操作相對方便而快捷。近來一系列研究表明，ASCs在體內及體外均具有低免疫原性及免疫抑制效應，也提供了其同種異體移植應用的理論依據。 然而，應用同種異

6、體來源的細胞，也存在交叉感染、安全性低的問題，因此，臨床醫(yī)師更傾向于應用自體細胞。我們選擇從脂肪組織中新鮮分離的自體血管基質片段細胞（SVFs）輔助脂肪移植，既可避免交叉感染，安全性高，又能一期即時完成手術，易于臨床推廣?？紤]到脂肪組織分布廣泛，抽脂術可獲取大量的脂肪，理論上，從這大量脂肪組織中新鮮分離，無需培養(yǎng)即可獲取足夠數量的、具有生物學活性的自體ASCs。 本實驗分別以新鮮分離的自體SVF細胞以及體外培養(yǎng)的同種異體ASCs

7、輔助脂肪移植，以培養(yǎng)的自體ASCs以及完全培養(yǎng)基作為對照，通過比較各組移植物濕重測量及HE染色切片分析，評價自體SVFs與同種異體ASCs對脂肪移植物存活率的影響，為臨床選擇一種更加安全、方便而有效的ASCs輔助干細胞療法提供參考。 [材料與方法] 1、成年兔ASCs的體外分離和培養(yǎng) 切取成年兔腹股溝皮下脂肪墊，使用酶消化法獲得SVF細胞，進行原代細胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)及功能變化。細胞傳至第4代后，分成

8、兩等份，分別用于自體及同種異體移植。 2、ASCs的Di-I體外標記 為示蹤脂肪干細胞，將新鮮分離的SVF細胞及培養(yǎng)的第4代ASCs在體外以Di-I標記，熒光顯微鏡觀察細胞顯色情況及形態(tài)變化。 3、兔細胞輔助脂肪移植（CAL）模型的建立 將Di-I標記后的，體外培養(yǎng)第4代自體ASCs（A組）、自體新鮮分離的ASCs（B組）、體外培養(yǎng)第4代的同種異體ASCs（C組）以及完全培養(yǎng)基（D組）與自體脂肪顆?；旌希?/p>

9、按隨機化原則注射于家兔腰背筋膜區(qū)皮下的四個受區(qū)（n=14）。 4、ASCs的Di-I體內示蹤 1例移植術后1個月取材，切片檢測Di-I紅色熒光，結合蘇木素染色切片顯示組織形態(tài)，以揭示ASCs在體內的分化轉歸。 5、脂肪移植物存活的評價 13例移植術后6個月取材。測量移植物濕重，切片HE染色，以Gunderson“點計數”法定量評價移植物纖維壞死及脂肪細胞存活情況，以及新生血管密度。 6、統計學分析

10、 所得數據以均數±標準差（x±s）表示；四組脂肪移植物平均濕重的比較，血管密度、存活脂肪組織點數及纖維壞死組織點數的比較均采用隨機區(qū)組設計資料的方差分析，各組均數的多重比較采用LSD法，P<0.05認為差異有統計學意義。 [結果] 1.術后6個月，自體ASCs組（A組）移植物濕重為（0.2693±0.0673）g，自體SVFs組（B組）濕重為（0.291±0.0721）g，同種異體ASCs組（C組）濕重為（0.2

11、579±0.0715）g，均顯著高于對照組（D組），（0.1778±0.06）g，P<0.05.A，B，C三組濕重均數之間兩兩比較，差異無顯著性，P>0.05。提示自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣，均可提高脂肪移植物的長期存活率。 2.A組血管截面計數為（12.7±3.1）個/HPF，B組為（13.2±3.7）個/HPF，C組為（11.2±2.5）個/HPF，均顯著高于對照組D組，（6.9±2.8）個/HPF，

12、P<0.05.A，B，C三組血管截面計數均數之間兩兩比較，差異無顯著性，P>0.05。說明自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣，均可促進脂肪移植物新生血管的形成。 3.A組切片存活的脂肪細胞計數為（6503±851）個/10HPF，B組為（6820±1021）個/10HPF，C組為（6658±858）個/10HPF，均顯著高于對照組D組，（905±383）/10HPF，P<0.05.A，B，C三組存活脂肪細胞計數均

13、數之間兩兩比較，差異無顯著性，P>0.05。結果顯示與自體ASCs一樣，經自體SVFs及同種異體ASCs干預后脂肪移植物中脂肪細胞的存活數量均較培養(yǎng)基對照組明顯增加。 4.A組切片纖維壞死細胞計數為（6336±848）個/10HPF，B組為（6135±918）個/10HPF，C組為（6181±829）個/10HPF，均顯著低于對照組D組，（11694±625）個/10HPF，P<0.05.A，B，C三組纖維壞死組織計數點均數之間

14、兩兩比較，差異無顯著性，P>0.05。結果顯示與自體ASCs一樣，經自體SVFs及同種異體ASCs干預后均可減少脂肪移植物中纖維組織的形成及脂肪細胞的壞死數量。 5.熒光顯微鏡下，A，B，C三組均發(fā)現血管內皮細胞部分激發(fā)紅色熒光。完全培養(yǎng)基對照組未發(fā)現此現象。結果提示自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣在體內可向血管內皮細胞分化，從而參與脂肪移植物的血管化進程。 [結論] 1.新鮮分離的自體SVFs