新鮮分離的脂肪血管基質(zhì)片段細(xì)胞促進(jìn)兔脂肪移植存活的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、臨床上因先天性畸形、外傷及腫瘤切除術(shù)等各種原因所造成的軟組織缺損的修復(fù)是整形修復(fù)外科面臨的重大難題之一。自體游離脂肪移植，自Neuber于1893年首先報(bào)道用以填充切除瘢痕后的缺損以來(lái)，已有100多年的歷史。相對(duì)于其他軟組織充填法而言，脂肪移植具有許多潛在的優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源豐富，易于獲取，無(wú)免疫原性，并且有良好的物理特性。 然而，脂肪移植物的低存活率及其體積存留的不可預(yù)知性，限制了其臨床應(yīng)用。移植物的存活期差異極大，且大塊移植物的體積

2、隨著時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)顯著減小。組織學(xué)檢測(cè)顯示移植的脂肪細(xì)胞進(jìn)行性減少，移植物逐漸被纖維組織替代，且通常伴有囊泡形成。研究表明，初期移植物只能靠周圍組織液的浸潤(rùn)和滲透來(lái)維持營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，而宿主的新生血管長(zhǎng)入移植物一般要在移植后5天并且只能侵入移植物的周邊部位，移植物中央部分的組織因缺血而壞死。因此臨床?？s小脂肪移植物的體積，以利于周圍營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的彌散及利用，直至新生血管形成。 顯然，移植物早期建立及時(shí)而充分的血供，是提高其存活率的關(guān)鍵。近年來(lái)

3、人們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可促進(jìn)新生血管形成以及抑制炎癥反應(yīng)，展示了干細(xì)胞在脂肪移植應(yīng)用中的美好前景。但應(yīng)用胚胎干細(xì)胞，會(huì)帶來(lái)倫理學(xué)的困擾，且細(xì)胞的生物學(xué)特性，如致腫瘤性及自發(fā)畸胎瘤形成等限制了其在非致命性疾病的治療。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為可再生的成體干細(xì)胞，具有成骨、成軟骨等多向分化能力，然而可收集的細(xì)胞數(shù)量少，需體外擴(kuò)增，取材伴隨的并發(fā)癥等也不利于臨床推廣。 脂肪來(lái)源干細(xì)胞（ASCs）可自切取的以及抽吸的脂肪中均能分離獲取。研究表明，形態(tài)

4、類似成纖維細(xì)胞的ASCs，與骨髓干細(xì)胞一樣，在體外具有向脂肪、骨、軟骨、神經(jīng)、心肌、平滑肌及骨骼肌等多個(gè)譜系分化的能力。值得一提的是ASCs可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，且在缺氧環(huán)境下可分泌促進(jìn)血管形成的細(xì)胞因子，從而促進(jìn)脂肪移植后的血管化進(jìn)程。 本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人ASCs混合脂肪顆粒移植于裸鼠皮下，促進(jìn)新生血管形成，顯著提高脂肪移植物的存活率。然而，體外培養(yǎng)獲取自體ASCs顯然無(wú)法完全滿足臨床需要。體外擴(kuò)增最少需要2

5、-3周的時(shí)間，這就意味者接受脂肪移植的患者需要二期手術(shù)。不僅如此，體外培養(yǎng)操作繁瑣，易污染，安全性低。 因此，如何安全、方便的獲取足夠數(shù)量的、具有生物學(xué)效應(yīng)的ASCs，是其應(yīng)用于脂肪移植臨床的關(guān)鍵。若能建立“脂肪干細(xì)胞庫(kù)”，可隨時(shí)獲取同種異體來(lái)源的ASCs，移植則可一期完成，操作相對(duì)方便而快捷。近來(lái)一系列研究表明，ASCs在體內(nèi)及體外均具有低免疫原性及免疫抑制效應(yīng)，也提供了其同種異體移植應(yīng)用的理論依據(jù)。 然而，應(yīng)用同種異

6、體來(lái)源的細(xì)胞，也存在交叉感染、安全性低的問(wèn)題，因此，臨床醫(yī)師更傾向于應(yīng)用自體細(xì)胞。我們選擇從脂肪組織中新鮮分離的自體血管基質(zhì)片段細(xì)胞（SVFs）輔助脂肪移植，既可避免交叉感染，安全性高，又能一期即時(shí)完成手術(shù)，易于臨床推廣。考慮到脂肪組織分布廣泛，抽脂術(shù)可獲取大量的脂肪，理論上，從這大量脂肪組織中新鮮分離，無(wú)需培養(yǎng)即可獲取足夠數(shù)量的、具有生物學(xué)活性的自體ASCs。 本實(shí)驗(yàn)分別以新鮮分離的自體SVF細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的同種異體ASCs

7、輔助脂肪移植，以培養(yǎng)的自體ASCs以及完全培養(yǎng)基作為對(duì)照，通過(guò)比較各組移植物濕重測(cè)量及HE染色切片分析，評(píng)價(jià)自體SVFs與同種異體ASCs對(duì)脂肪移植物存活率的影響，為臨床選擇一種更加安全、方便而有效的ASCs輔助干細(xì)胞療法提供參考。 [材料與方法] 1、成年兔ASCs的體外分離和培養(yǎng) 切取成年兔腹股溝皮下脂肪墊，使用酶消化法獲得SVF細(xì)胞，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及功能變化。細(xì)胞傳至第4代后，分成

8、兩等份，分別用于自體及同種異體移植。 2、ASCs的Di-I體外標(biāo)記 為示蹤脂肪干細(xì)胞，將新鮮分離的SVF細(xì)胞及培養(yǎng)的第4代ASCs在體外以Di-I標(biāo)記，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞顯色情況及形態(tài)變化。 3、兔細(xì)胞輔助脂肪移植（CAL）模型的建立 將Di-I標(biāo)記后的，體外培養(yǎng)第4代自體ASCs（A組）、自體新鮮分離的ASCs（B組）、體外培養(yǎng)第4代的同種異體ASCs（C組）以及完全培養(yǎng)基（D組）與自體脂肪顆粒混合，

9、按隨機(jī)化原則注射于家兔腰背筋膜區(qū)皮下的四個(gè)受區(qū)（n=14）。 4、ASCs的Di-I體內(nèi)示蹤 1例移植術(shù)后1個(gè)月取材，切片檢測(cè)Di-I紅色熒光，結(jié)合蘇木素染色切片顯示組織形態(tài)，以揭示ASCs在體內(nèi)的分化轉(zhuǎn)歸。 5、脂肪移植物存活的評(píng)價(jià) 13例移植術(shù)后6個(gè)月取材。測(cè)量移植物濕重，切片HE染色，以Gunderson“點(diǎn)計(jì)數(shù)”法定量評(píng)價(jià)移植物纖維壞死及脂肪細(xì)胞存活情況，以及新生血管密度。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

10、 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；四組脂肪移植物平均濕重的比較，血管密度、存活脂肪組織點(diǎn)數(shù)及纖維壞死組織點(diǎn)數(shù)的比較均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析，各組均數(shù)的多重比較采用LSD法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.術(shù)后6個(gè)月，自體ASCs組（A組）移植物濕重為（0.2693±0.0673）g，自體SVFs組（B組）濕重為（0.291±0.0721）g，同種異體ASCs組（C組）濕重為（0.2

11、579±0.0715）g，均顯著高于對(duì)照組（D組），（0.1778±0.06）g，P<0.05.A，B，C三組濕重均數(shù)之間兩兩比較，差異無(wú)顯著性，P>0.05。提示自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣，均可提高脂肪移植物的長(zhǎng)期存活率。 2.A組血管截面計(jì)數(shù)為（12.7±3.1）個(gè)/HPF，B組為（13.2±3.7）個(gè)/HPF，C組為（11.2±2.5）個(gè)/HPF，均顯著高于對(duì)照組D組，（6.9±2.8）個(gè)/HPF，

12、P<0.05.A，B，C三組血管截面計(jì)數(shù)均數(shù)之間兩兩比較，差異無(wú)顯著性，P>0.05。說(shuō)明自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣，均可促進(jìn)脂肪移植物新生血管的形成。 3.A組切片存活的脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)為（6503±851）個(gè)/10HPF，B組為（6820±1021）個(gè)/10HPF，C組為（6658±858）個(gè)/10HPF，均顯著高于對(duì)照組D組，（905±383）/10HPF，P<0.05.A，B，C三組存活脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)均

13、數(shù)之間兩兩比較，差異無(wú)顯著性，P>0.05。結(jié)果顯示與自體ASCs一樣，經(jīng)自體SVFs及同種異體ASCs干預(yù)后脂肪移植物中脂肪細(xì)胞的存活數(shù)量均較培養(yǎng)基對(duì)照組明顯增加。 4.A組切片纖維壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)為（6336±848）個(gè)/10HPF，B組為（6135±918）個(gè)/10HPF，C組為（6181±829）個(gè)/10HPF，均顯著低于對(duì)照組D組，（11694±625）個(gè)/10HPF，P<0.05.A，B，C三組纖維壞死組織計(jì)數(shù)點(diǎn)均數(shù)之間

14、兩兩比較，差異無(wú)顯著性，P>0.05。結(jié)果顯示與自體ASCs一樣，經(jīng)自體SVFs及同種異體ASCs干預(yù)后均可減少脂肪移植物中纖維組織的形成及脂肪細(xì)胞的壞死數(shù)量。 5.熒光顯微鏡下，A，B，C三組均發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞部分激發(fā)紅色熒光。完全培養(yǎng)基對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。結(jié)果提示自體SVFs及同種異體ASCs，與自體ASCs一樣在體內(nèi)可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，從而參與脂肪移植物的血管化進(jìn)程。 [結(jié)論] 1.新鮮分離的自體SVFs