基因芯片聯(lián)合組織芯片探討原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制.pdf

1、背景和研究目的：肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后極差。在亞洲和非洲成人中已經(jīng)成為癌癥相關(guān)死亡的首要原因。盡管目前肝癌的臨床診治研究取得了較大進(jìn)步，但預(yù)后仍然很差。即便在有最好的預(yù)后指數(shù)和可以接受外科治療的患者中，5年生存率仍然低于25﹪，主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，迫切需要對(duì)HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)行深入探索。 HCC的發(fā)生與很多危險(xiǎn)因素有關(guān)，通常發(fā)生于

2、肝硬化背景。對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的廣泛研究已經(jīng)闡明，從癌前病變發(fā)展為HCC經(jīng)歷了復(fù)雜的過(guò)程，包含一系列基因或染色體的異常。這些遺傳學(xué)異常包括雜合性丟失(lossofheterozygosity，LOH)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、基因突變以及基因表達(dá)譜的變化等。盡管一些基因變化在HCC的發(fā)生過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，如p53家族、Rb家族和Wnt信號(hào)通路等，然而不同病因HCC的分子基礎(chǔ)是不同的。近期有研究應(yīng)用DNA基因芯片技術(shù)鑒定出HBV和HCV相關(guān)H

3、CC的獨(dú)特基因表達(dá)譜。同時(shí)，基因表達(dá)譜還有助于我們鑒別HCC與正常肝組織以及癌前病變，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的潛能。這些與形成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的獨(dú)特基因或基因產(chǎn)物可以視為早期診斷、預(yù)后判斷和治療療效的分子標(biāo)志物。但目前這些分散的報(bào)道仍不能給出HCC分子機(jī)制的清晰全貌，我們?nèi)悦媾R解碼HCC分子機(jī)制的巨大挑戰(zhàn)。 生物芯片技術(shù)的誕生，開(kāi)創(chuàng)了醫(yī)學(xué)的新紀(jì)元，使我們能夠同時(shí)對(duì)許多基因進(jìn)行分析。高通量的基因組技術(shù)，如DNA基因芯片，使得我們探索人類(lèi)腫瘤的分

4、子全貌變的更加便利，成千上萬(wàn)的基因可以在一張雜交芯片上進(jìn)行分析。單一腫瘤的基因表達(dá)譜可以反映某一特定時(shí)間點(diǎn)的特定狀態(tài)。而總結(jié)數(shù)百個(gè)體的差異基因表達(dá)譜結(jié)果，可以得出腫瘤的概括性分子變化。應(yīng)用傳統(tǒng)分子病理學(xué)方法，可能需要數(shù)月甚至數(shù)年才能完成上述工作。為了便于進(jìn)行大規(guī)模功能水平的研究，組織芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。組織芯片可以同時(shí)原位評(píng)價(jià)上千種腫瘤的基因拷貝數(shù)以及蛋白表達(dá)情況。目前國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道絕大多數(shù)是分析某一種因素變化前后的差異，如HBV感染與

5、否、環(huán)境致癌物接觸與否、轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā)與否、化療藥物敏感與否等等，鮮見(jiàn)對(duì)疾病發(fā)展過(guò)程進(jìn)行兩種或以上表達(dá)譜的綜合分析。 本研究擬聯(lián)合cDNA基因芯片和組織芯片鑒定人類(lèi)HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的差異表達(dá)基因，考察相關(guān)差異表達(dá)基因與HCC臨床病理特征之間以及基因相互之間的相關(guān)性，揭示HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制全貌，為臨床診治提供新的潛在靶點(diǎn)。 材料與方法：1、收集10例施行正位肝移植的HCC患者的癌、癌旁和正常肝組織，應(yīng)用H&E染色

6、確認(rèn)相關(guān)組織的病理類(lèi)型，應(yīng)用Trizol一步法抽提配對(duì)組織的總RNA；2、應(yīng)用1﹪瓊脂糖凝膠電泳和芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-chip)進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)；3、按QIAGENRNeasy(R)MiniKit說(shuō)明，進(jìn)行總RNA純化、逆轉(zhuǎn)錄cRNA合成、熒光標(biāo)記和純化；4、將癌組織和正常肝組織、癌組織和癌旁肝組織的cRNA探針?lè)謩e與Agilent寡核苷酸芯片(21,073探針)進(jìn)行雜交，洗滌后應(yīng)用AgilentScanner獲取圖像，應(yīng)用Fe

7、atureExtraction軟件進(jìn)行定量分析處理，應(yīng)用cluster分析軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，通過(guò)Treeview軟件以樹(shù)狀圖形式顯示；5、挑選明顯差異表達(dá)的代表基因4個(gè)，其中包括上調(diào)和下調(diào)基因各2個(gè)，以β-actin為內(nèi)對(duì)照基因，由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成目的基因引物前導(dǎo)鏈和后隨鏈，按InvitrogenRT-PCRkit說(shuō)明進(jìn)行SYBRGreenI染料摻入的熒光realtimeRT-PCR絕對(duì)定量驗(yàn)證分析；6、挑選差異表達(dá)的代表基因6

8、個(gè)，其中包括5個(gè)上調(diào)基因和1個(gè)下調(diào)基因，在高通量肝癌特異性組織芯片(產(chǎn)品批號(hào)：OD-CT-DgLiv01-001)上應(yīng)用S-P法驗(yàn)證代表基因在蛋白水平的表達(dá)，采用SPSS10.0軟件包分析相關(guān)基因的表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)之間以及基因相互之間的相關(guān)性。 結(jié)果：1、H&E染色結(jié)果顯示癌、癌旁以及正常肝組織呈現(xiàn)典型的組織病理變化，1﹪瓊脂糖凝膠電泳和Lab-on-chip電泳結(jié)果均提示提示配對(duì)組織總RNA的質(zhì)量高，無(wú)降解現(xiàn)象。2、高

9、通量Agilent寡核苷酸芯片掃描發(fā)現(xiàn)在癌和癌旁組織的差異基因表達(dá)譜中，2倍上調(diào)的的差異表達(dá)基因(diffrentiallyexpressedgenes，DEGs)共1295個(gè)，而癌與正常肝組織的數(shù)目為1074個(gè)，綜合兩者的共同DEGs，共420個(gè)；相應(yīng)的，在癌和癌旁組織2倍下調(diào)的DEGs共1320個(gè)，而癌與正常肝組織的數(shù)目為1107個(gè)，共同下調(diào)的DEGs為552個(gè)。3、Cluster聚類(lèi)分析顯示HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及癌基因與抑癌基因

10、、編碼離子通道和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因、編碼細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的基因、與細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的基因、細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因、調(diào)節(jié)DNA合成、修復(fù)和重排相關(guān)的基因、細(xì)胞因子受體相關(guān)基因、免疫蛋白相關(guān)基因、細(xì)胞代謝相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的基因、與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因等，尚有部分基因不能分類(lèi)或?yàn)楸磉_(dá)序列標(biāo)簽(expressionsequencetags，ESTs)。4、差異基因表達(dá)譜中，包含12個(gè)5倍以上上調(diào)表達(dá)的基因，分

11、別是CTHRC1、UCHL1、PPP1R9A、CTSL2、POSTN、NQO1、DKK1、AGR2、MMP-12、SULT1C1、LAPTM4B和PEG10；7個(gè)10倍以上下調(diào)表達(dá)的基因，分別是3個(gè)細(xì)胞色素P450基因(CYP2C9、CYP2A7和CYP2C8)、HPD、ADH4、GLS2和CPS1。5、熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，β-actin在癌、癌旁和正常肝組織中的Ct值為19.26、21.79和19.08，DKK1基因在相

12、應(yīng)組織中擴(kuò)增的比值分別為：癌/正常(C/N)為141.89，癌/癌旁(C/P)為11.70。相應(yīng)的，MMP-12、CYP2A7和CYP2C8的C/N值分別是60.70、0.14和0.03，C/P值分別是2.82、0.21和0.02，結(jié)果與Agilent芯片掃描結(jié)果一致。6、6個(gè)代表基因，包括Survivin、OPN、HIF-1α、p53、COX-2和Syndecan-1，在高通量肝癌特異性組織芯片上的表達(dá)結(jié)果顯示：Survivin在HC

13、C組織中的陽(yáng)性率為88.5﹪，而肝硬化組織和正常肝組織的陽(yáng)性率分別為63.2﹪和10﹪，差異具有顯著性(p=0.043、0.001)；OPN在HCC組織中的陽(yáng)性率占73.3﹪，與正常肝組織相比，明顯升高(p=0.030)。而肝硬化組織的染色陽(yáng)性率為47.4﹪，與HCC組織比較，差異亦有顯著性(p=0.041)。HIF-1α在HCC組織中的陽(yáng)性率占66.2﹪，與正常肝組織相比，明顯升高(p=0.013)。而肝硬化組織的染色陽(yáng)性率為65.0

14、﹪，與HCC組織比較，差異沒(méi)有顯著性(p=0.830)。p53在HCC組織中的陽(yáng)性率占56.1﹪，與正常肝組織相比，明顯升高(p=0.000)。而肝硬化組織的染色陽(yáng)性率為30.0﹪，與HCC組織比較，差異具有顯著性(p=0.038)。COX-2在HCC組織中的陽(yáng)性率占62.7﹪，與正常肝組織相比，明顯升高(p=0.011)。而肝硬化組織的染色陽(yáng)性率為15.0﹪，與HCC組織比較，差異亦有顯著性(p=0.030)。Syndecan-1在H

15、CC組織中的陽(yáng)性率占19.6﹪，正常肝組織的陽(yáng)性率為90﹪，而肝硬化組織的染色陽(yáng)性率為35.0﹪，與HCC組織比較，均具有顯著性差異(p=0.001、0.032)。7、單因素分析結(jié)果提示Survivin、HIF-1α和Syndecan-1與HCC的病理組織分級(jí)相關(guān)；除Survivin外，其它分子與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)；OPN和Syndecan-1與HCC腫瘤有無(wú)包膜相關(guān)；OPN、p53和COX-2與門(mén)靜脈有無(wú)癌栓相關(guān)。8、蛋白之間的相關(guān)性分

16、析提示，OPN與Syndecan-1之間存在負(fù)相關(guān)(r=-0.439，p=0.003)，而HIF-1α與p53之間存在正相關(guān)(r=0.426，p=0.002)。 結(jié)論：1、HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，涉及諸多基因的表達(dá)變化，單一基因或信號(hào)通路途徑不足以解釋HCC分子機(jī)制的全貌。本研究通過(guò)對(duì)癌與癌旁、癌與正常肝組織的差異基因表達(dá)譜進(jìn)行分析綜合，為探索腫瘤的分子機(jī)制提供了新的思路。2、應(yīng)用基因芯片聯(lián)合組織芯片可以高通量、高效率地分

17、析HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的基因表達(dá)差異，篩選新的治療靶點(diǎn)，是研究人類(lèi)重大疾病的新趨勢(shì)。3、HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中涉及數(shù)以千計(jì)的差異表達(dá)基因，其中12個(gè)5倍以上上調(diào)表達(dá)基因與HCC的相關(guān)性既往鮮見(jiàn)研究報(bào)道。7個(gè)10倍以上下調(diào)表達(dá)基因或者與環(huán)境致癌物的代謝相關(guān)，或者與外源性/內(nèi)源性化合物的解毒有關(guān)，可能是潛在的治療靶點(diǎn)，為深入研究HCC的分子機(jī)制提供了很多新課題。4、通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR和高通量肝癌特異性組織芯片技術(shù)考察目的基因在mR

18、NA和蛋白水平的表達(dá)，映證了基因芯片結(jié)果的一致性。5、單因素分析結(jié)果提示Survivin、HIF-1α和Syndecan-1與HCC的病理組織分級(jí)相關(guān)；除Survivin外，其它分子與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)；OPN和Syndecan-1與HCC腫瘤有無(wú)包膜相關(guān)；OPN、p53和COX-2與門(mén)靜脈有無(wú)癌栓相關(guān)。蛋白之間的相關(guān)性分析提示，OPN可能通過(guò)下調(diào)Syndecan-1的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞之間的粘附性，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。而p53的激活可能