應(yīng)用基因芯片技術(shù)探討口腔扁平苔蘚發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的:口腔扁平苔蘚是一種常見(jiàn)的非感染性口腔黏膜疾病,不易治愈,有一定的癌變傾向。該病好發(fā)于中年人,多見(jiàn)于40歲以上婦女,隨年齡增長(zhǎng)癥狀加重。該病病因不明,發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜。近年來(lái),口腔扁平苔蘚的癌變病例報(bào)道呈上升趨勢(shì),因此,對(duì)口腔扁平苔蘚發(fā)病機(jī)制的研究成為口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)是目前國(guó)際上興起不久且發(fā)展迅速的一項(xiàng)生物技術(shù),它在生命科學(xué)領(lǐng)域扮演著越來(lái)越重要的角色。基因芯片技術(shù)是目前基因研究方面最先進(jìn)、最有效的方法之一,隨著生物學(xué)

2、技術(shù)的發(fā)展,基因芯片技術(shù)越來(lái)越廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)制的研究,從而發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選口腔扁平苔蘚與正常口腔黏膜組織差異表達(dá)基因及其信號(hào)傳導(dǎo)通路,分析口腔扁平苔蘚發(fā)病相關(guān)的差異表達(dá)基因和信號(hào)傳導(dǎo)通路,進(jìn)而對(duì)口腔扁平苔蘚的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　 方法:
　　 1樣本采集
　　 所有病變組織均來(lái)源于2008年5月至11月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科臨床診斷為口腔扁平苔癬的患者,并經(jīng)知情同意取

3、病理時(shí)切取少量病變黏膜(組織病理診斷為口腔扁平苔蘚的繼續(xù)保留)。標(biāo)本于切除后10 min內(nèi)裝入經(jīng)無(wú)菌DEPC處理的凍存管中,然后儲(chǔ)存于液氮罐中轉(zhuǎn)運(yùn)到低溫冰箱中保存。對(duì)照正常組織來(lái)源于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科無(wú)菌條件下健康者拔智齒時(shí)切除的齦黏膜或口腔整復(fù)術(shù)中切除的口腔黏膜,保存方法同OLP組織標(biāo)本。
　　 2芯片的制作
　　 由上?？党杉夹g(shù)有限公司提供的含有32050個(gè)基因的高密度基因組芯片(phalanx臺(tái)灣)。取適量

4、(50～100 mg)正確保存的OLP組織樣本和正常組織,分別使用BioPulverize冰凍粉碎組織,加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。使用Nanodrop測(cè)定RNA在分光光度計(jì)230 nm、260 nm和280 nm的吸收值,以計(jì)算濃度并評(píng)估純度。用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)RNA純度及完整性。取得RNAOC報(bào)告。經(jīng)檢測(cè)的RNA樣本

5、是高質(zhì)量的,完整的,沒(méi)有Rnase污染,沒(méi)有DNA污染,繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。樣本RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,cDNA第二鏈合成,aRNA合成及純化,熒光標(biāo)記aRNA并純化。使用Nanodrop檢測(cè)熒光標(biāo)記效率,標(biāo)記效率合格以保證后續(xù)芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。使用Ambion的RNA FragmentationReagents對(duì)標(biāo)記好的aRNA進(jìn)行片段化處理。在標(biāo)準(zhǔn)條件下將標(biāo)記好的探針和高密度基因組芯片進(jìn)行雜交。
　　 3芯片掃描和圖像分

6、析
　　 使用GenePix4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度,并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存,使用配套軟件(Genepix Pro V6.0和Genesring)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算,采用FoldChang和T-test方法篩選的兩組樣本間的差異表達(dá)基因和通路,以表達(dá)差異2倍為陽(yáng)性,為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4 RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果的可靠性
　　 本實(shí)驗(yàn)為了排除實(shí)驗(yàn)結(jié)果中篩選差異基因的錯(cuò)誤和假陽(yáng)性,對(duì)實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果部分標(biāo)本的部分基因采用RT-PCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取7例標(biāo)本(3例正常和4例OLP)并隨機(jī)選取3個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因(PHF19、DBH、CD72)進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證,為校正此差異,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增。引物序列為:GAPDH:反義5'GGGAAACTGTGGCGTGAT3',正義:5'GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3',片段長(zhǎng)度為299 bp。PHF19::反義F:5'CGGGAAGATCAAGAGGGTC

8、A3',正義:R:5'ATGCAGCGTCGGCAGAAC3',片段長(zhǎng)度為276bp。DBH:反義F:5'TGGTGATAGAAGGACGAAACG3',正義:R:5'GCAGTAGCCAGTGAGGATGAA3',片段長(zhǎng)度為158bp。CD72:反義F:5'CCAAATGGTGGTTCAGGGA3',正義:R:5'GGCACAGGTTCTTGTTGGC3',片段長(zhǎng)度為265bp。PCR反應(yīng)條件:95℃變性3min,40個(gè)PCR循環(huán)(9

9、4℃,20s;59℃,20s;72℃,30s);72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參照,復(fù)性溫度及循環(huán)次數(shù)根據(jù)不同引物及模板進(jìn)行調(diào)整PCR產(chǎn)物與100 bp DNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶并進(jìn)行灰度掃描成像。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果由Rotor-GeneReal-Time Analysis Software6.0(Build14)軟件處理。
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10、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 應(yīng)用Spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)各組間比較利用單樣本均數(shù)比較T檢驗(yàn)分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1經(jīng)過(guò)雜交篩選并與正常組織比較,從32050個(gè)基因中篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因142個(gè),其中上調(diào)表達(dá)基因25個(gè),下調(diào)表達(dá)基因117個(gè)。這些差異基因從分子生物學(xué)角度來(lái)說(shuō)大部分是細(xì)胞突變、生理性改變免疫應(yīng)答、增殖等。從細(xì)胞組成角度來(lái)講大多是細(xì)胞器、

11、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白質(zhì)的合成等。從分子功能角度講大多是黏附、催化活性、信號(hào)傳導(dǎo)功能、酶的活性等。
　　 2有差異表達(dá)的通路8個(gè),為感染類疾病相關(guān)通路,氨基酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物的合成和代謝類、聚糖的生物合成和代謝類及外源性化學(xué)物質(zhì)的合成和代謝類,與OLP密切相關(guān)通路是與參與感染類疾病的幽門螺桿菌感染上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路(Epithelial cell signaling in Helicobacter pyloriinfection