淫羊藿苷促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)愈合的影響和機(jī)制的探討.pdf

1、目的:
　　 由于感染，外傷，腫瘤，先后天畸形，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病造成的骨缺損，畸形，功能障礙，給患者的生活質(zhì)量帶來(lái)很大的影響，尤其是對(duì)于口腔頜面部。因此尋找一種簡(jiǎn)便、快捷、有效的方法促進(jìn)骨創(chuàng)的修復(fù)，成為外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 目前對(duì)如何促進(jìn)骨愈合的研究很多。一些高分子生物材料植入，人工替代物植入，自體骨移植，組織工程化骨移植，低強(qiáng)度脈沖電磁場(chǎng)治療等均有一定療效，由于都存在或多或少的缺點(diǎn)，未能在臨床上廣泛應(yīng)用。

2、r>　　 多年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者借助組織學(xué)、組織化學(xué)，組織形態(tài)計(jì)量學(xué)，生物力學(xué)等手段對(duì)骨創(chuàng)愈合進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)觀察，對(duì)骨創(chuàng)愈合機(jī)制也進(jìn)行了廣泛的探討。近年來(lái)，由于基因技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，人們對(duì)骨創(chuàng)愈合的認(rèn)識(shí)已從細(xì)胞生物學(xué)向分子生物學(xué)水平深化，并隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到骨創(chuàng)愈合與多種生長(zhǎng)因子有關(guān)，除內(nèi)分泌、代謝因子等全身因子外，骨創(chuàng)局部尚有大量的生長(zhǎng)因子，對(duì)骨創(chuàng)愈合起著重要的調(diào)節(jié)作用，如:TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)，VEGF(血管

3、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，F(xiàn)GF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nervegrowthfactor，NGF)等。
　　 中藥對(duì)加速骨折愈合機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究始自上世紀(jì)60年代，大致有如下幾個(gè)方面的成果:中藥改善骨折部的血液供應(yīng)，促進(jìn)血腫的吸收與機(jī)化;促進(jìn)礦物質(zhì)的沉積;增加成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性，提高微量元素等。淫羊藿(Herbaepimedii)是一種傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，臨床上用來(lái)治療骨折及與骨代謝有關(guān)的許多疾病

4、，并取得了良好的效果。研究結(jié)果表明，淫羊藿具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抗腫瘤，影響內(nèi)分泌加強(qiáng)性腺功能、延緩衰老和影響心血管系統(tǒng)等多種重要的藥理活性。淫羊藿的有效活性成分淫羊藿苷(icariin，C33H40O15，分子量:676.67)，屬黃酮類化合物。李芳芳等將淫羊藿苷與大鼠卵泡顆粒細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，顯示一定濃度的淫羊藿苷可促使卵泡顆粒細(xì)胞分泌雌二醇，高濃度時(shí)還可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞分泌皮質(zhì)類固醇，提示淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)功效:作用下丘

5、腦垂體-性腺軸及腎上腺軸，可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)激素的水平，改善骨代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。由于淫羊藿苷在骨創(chuàng)愈合，修復(fù)中起到積極的作用，淫羊藿在促進(jìn)骨愈合方面的研究成為研究熱點(diǎn)，淫羊藿提取物:淫羊藿苷對(duì)成骨細(xì)胞增殖代謝的影響，體外實(shí)驗(yàn)董福生課題組已經(jīng)完成。
　　 本研究通過(guò)制作新西蘭大白兔顱骨模型，術(shù)后采用淫羊藿苷灌胃，應(yīng)用組織學(xué)和骨計(jì)量學(xué)方法，觀察在骨缺損不同的愈合階段，顱骨缺損區(qū)新生骨量，骨愈合速度和成骨質(zhì)量。
　　 同時(shí)提取

6、顱骨缺損修復(fù)區(qū)新生骨組織mRNA，采用RT-PCR(realtime-polymerasechainreaction)方法，檢測(cè)成骨細(xì)胞促進(jìn)骨生成的基因變化情況，進(jìn)一步研究在新骨形成的過(guò)程中和應(yīng)用淫羊藿苷治療后，相關(guān)基因的變化，相互聯(lián)系，尋找成骨的分子信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　 在以上研究的基礎(chǔ)上，通免疫組化方法，觀察新骨形成區(qū)骨鈣素和骨橋素的表達(dá)，初步探討淫羊藿苷促進(jìn)骨形成的機(jī)制。為淫羊藿苷在促進(jìn)骨愈合的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，奠定基

7、礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、淫羊藿苷對(duì)兔顱骨缺損修復(fù)愈合質(zhì)量的影響
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，隨機(jī)分為用藥組和對(duì)照組，制作顱骨缺損動(dòng)物模型，用藥組術(shù)后給予淫羊藿苷灌胃，分別于術(shù)后4周、8周、12周處死動(dòng)物，留取標(biāo)本，拍射X線片觀察;制作組織切片，HE染色，觀察顱骨缺損區(qū)愈合情況;骨計(jì)量學(xué)觀察新骨形成區(qū)骨小梁平均寬度(TraberculaeWidth，Tb·Wiμm)，骨小梁面積比(Trabercular

8、AreaTb.Ar％)，成骨細(xì)胞個(gè)數(shù)(OsteoblastNumber,OB·N)，破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)(OsteoclastNumber,OC·N)，觀察新骨形成區(qū)骨量的變化，研究淫羊藿苷對(duì)兔顱骨缺損愈合的影響。
　　 2、淫羊藿苷促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)RANKL基因、RUNX2基因表達(dá)的影響
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，動(dòng)物分組，動(dòng)物模型制作，動(dòng)物給藥方法和劑量同第一部分，分別于術(shù)后4周、8周、12周留取標(biāo)本后，提取顱骨缺

9、損修復(fù)區(qū)新生骨組織mRNA，采用RT-PCR(realtime-polymerasechainreaction)方法，檢測(cè)成骨細(xì)胞促進(jìn)骨生成的基因變化情況，本部分實(shí)驗(yàn)所研究差異表達(dá)基因的重點(diǎn):是關(guān)于成骨細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)、成骨細(xì)胞功能調(diào)節(jié)和骨代謝調(diào)節(jié)等方面。
　　 3、淫羊藿苷促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)區(qū)成骨相關(guān)蛋白骨鈣素、骨橋素的表達(dá)
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，動(dòng)物分組，動(dòng)物模型制作，動(dòng)物給藥方法和劑量同第一部分，分別于

10、術(shù)后4周、8周、12周留取標(biāo)本后，通過(guò)免疫組化方法，觀察新骨形成區(qū)成骨細(xì)胞骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)情況:骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、淫羊藿苷對(duì)兔顱骨缺損修復(fù)愈合質(zhì)量的影響
　　 1.1、一般觀察
　　 術(shù)后4周，對(duì)照組骨缺損區(qū)微凹陷，為纖維組織覆蓋，邊界清晰可辯，周邊未見明顯新骨形成。實(shí)驗(yàn)組顱骨缺損區(qū)中央局部凹陷，邊界模糊不清，周圍可見少量薄、半透明新骨生長(zhǎng)。
　　 術(shù)后8周，對(duì)照

11、組骨缺損區(qū)表面及周邊部骨痂形成，中央部略凹陷，較邊緣為薄。實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)被均勻的硬組織覆蓋，與周邊骨質(zhì)有明顯骨融合。
　　 術(shù)后12周，對(duì)照組骨缺損區(qū)表面及周邊部骨痂形成，形態(tài)基本接近正常顱骨外形。實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)可見新形成的骨組織覆蓋，與邊緣無(wú)明顯界限。
　　 1.2、X線觀察
　　 術(shù)后4周，對(duì)照組骨缺損處為低密度影，骨缺損邊清晰。實(shí)驗(yàn)組缺損處為低密度影，骨缺損邊緣模糊。
　　 術(shù)后8周，對(duì)照組骨缺損區(qū)

12、域密度低于缺損周圍骨質(zhì)，與正常組織間界限明顯。實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)域內(nèi)密度略高于對(duì)照組，界限模糊，缺損范圍明顯縮小。
　　 術(shù)后12周，對(duì)照骨組缺損區(qū)域呈骨性低密度區(qū)，與正常組織間界限明顯。實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)域與周圍骨質(zhì)無(wú)明顯界限，密度基本一致。
　　 1.3、組織學(xué)觀察
　　 術(shù)后4周，對(duì)照組可見缺損邊緣有少量類骨質(zhì)和新骨形成，中央為纖維組織，大量的炎性細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)中央為纖維結(jié)締組織充填，可見粗大的膠原纖維，

13、中間散在少量炎性細(xì)胞，部分區(qū)域出現(xiàn)纖維骨樣結(jié)構(gòu)，大量新生骨質(zhì)，成骨細(xì)胞較多成柵欄狀排列在骨小梁周圍。
　　 術(shù)后8周，對(duì)照組缺損區(qū)存在大量結(jié)構(gòu)疏松的纖維結(jié)締組織，且炎癥細(xì)胞仍廣泛存在，缺損區(qū)邊界有部分骨樣和纖維骨樣組織生成，其內(nèi)有一定量的成骨細(xì)胞存在。實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)內(nèi)有大量骨質(zhì)形成，骨小梁連續(xù)，增厚，形成板層結(jié)構(gòu)，部分成網(wǎng)織狀，為較成熟骨，部分區(qū)域內(nèi)骨質(zhì)致密，形成板層狀骨，中央為骨髓腔。
　　 術(shù)后12周，對(duì)照組新生骨向中

14、央逐漸充填骨缺損，缺損內(nèi)可見較多新生的編織骨及板層骨。骨小梁連續(xù)，細(xì)胞成分較少，纖維成分較實(shí)驗(yàn)組多。實(shí)驗(yàn)組骨缺損處為成熟骨質(zhì)，骨細(xì)胞豐富，骨小梁粗大，排列整齊，較明顯的骨髓腔出現(xiàn)并連續(xù)。
　　 1.4、骨計(jì)量學(xué)觀察
　　 術(shù)后4周，用藥組與對(duì)照組比較:用藥組的松質(zhì)區(qū)骨量(Tb·Ar％)，骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細(xì)胞個(gè)數(shù)(OB·N)均明顯大于對(duì)照組(P＜0.01);破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)(CB·N)明顯低于對(duì)照組(P＜0.

15、01)。術(shù)后8周，用藥組與對(duì)照組比較:用藥組的松質(zhì)區(qū)骨量（Tb·Ar％），骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細(xì)胞個(gè)數(shù)(OB·N)均明顯大于對(duì)照。組(P＜0.01);破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)(CB·N)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。術(shù)后12周，用藥組與對(duì)照組比較:用藥組的松質(zhì)區(qū)骨量（Tb·Ar％），骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細(xì)胞個(gè)數(shù)(OB·N)均明顯大于對(duì)照組(P＜0.01);破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)(CB·N)兩組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。<

16、br>　　 2、淫羊藿苷促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)RANKL基因、RUNX2基因表達(dá)的影響
　　 2.1、mRNA純度及完整性鑒定
　　 分光光度法測(cè)定結(jié)果顯示:對(duì)照組及用藥組總RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，純度及濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:對(duì)照組及用藥組總RNA經(jīng)變性凝膠電泳后可見明顯的28S及18S條帶出現(xiàn)，28S條帶亮度約為18S條帶的兩倍，各組提取的RNA完整性良

17、好，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　 2.2、Real-timePCR定量分析結(jié)果
　　 在術(shù)后4周，8周，12周時(shí)用藥組和對(duì)照組Rank1、Runx2基因的mRNA表達(dá)結(jié)果:在術(shù)后4周，8周，12周時(shí)Rank1基因表達(dá)水平用藥組均明顯低于對(duì)照組，Runx2基因的表達(dá)水平用藥組均明顯高于對(duì)照組。
　　 3、淫羊藿苷促進(jìn)兔顱骨缺損修區(qū)成骨相關(guān)蛋白骨鈣素，骨橋素的表達(dá)
　　 3.1、骨鈣素OC在新骨形成區(qū)的表達(dá)
　

18、　 用藥后4周，實(shí)驗(yàn)組骨鈣素OC的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性;對(duì)照組，OC在成骨細(xì)胞的胞漿和骨基質(zhì)中陰性表達(dá)。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組OC的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，對(duì)照組呈弱陽(yáng)性表達(dá)。12時(shí)周實(shí)驗(yàn)組OC的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，對(duì)照組呈弱陽(yáng)性表達(dá)。
　　 3.2、骨橋素OPN在新骨形成區(qū)的表達(dá)
　　 用藥后4周實(shí)驗(yàn)組骨橋素OPN在成骨細(xì)胞的胞漿中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在骨基質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組呈陰性表達(dá)。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組OPN的表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性;對(duì)照組呈弱陽(yáng)性表達(dá)。12周時(shí)實(shí)

19、驗(yàn)組OPN在呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);對(duì)照組呈弱陽(yáng)性表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、淫羊藿苷能夠增加兔顱骨缺損區(qū)成骨骨量，提高愈合質(zhì)量。
　　 2、淫羊藿苷能夠促進(jìn)兔顱骨缺損愈合，加快顱骨缺損的愈合速度。
　　 3、淫羊藿苷在成骨過(guò)程中，發(fā)揮雌激素樣作用，通過(guò)下調(diào)Rank1基因，減少破骨細(xì)胞的活化，抑制破骨細(xì)胞的功能，增加成骨。
　　 4、淫羊藿苷能上調(diào)成骨基因Runx2，通過(guò)經(jīng)典Wnt/β-catenin途