淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進兔顱骨缺損修復(fù)的分子機制探討.pdf

1、目的:
　　本研究通過建立兔顱骨缺損模型，分別通過淫羊藿苷灌胃全身用藥、CGF纖維蛋白凝膠膜覆蓋顱骨缺損面，在不同時間點采用大體觀察、X線觀察、組織學觀察、骨組織形態(tài)計量學研究，探討淫羊藿苷、CGF促進骨缺損的誘導(dǎo)作用，采用兔全基因組芯片分析淫羊藿苷、CGF對促進兔顱骨缺損修復(fù)過程中基因表達譜差異。采用Real-TimePCR和Western blot分析的方法探討淫羊藿苷、CGF促進兔顱骨缺損修復(fù)主要信號誘導(dǎo)通路。
　　方

2、法:
　　第一部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進兔顱骨缺損修復(fù)形態(tài)學觀察
　　1.動物及分組:72只新西蘭大白兔隨機分為對照組、淫羊藿苷組和CGF組。
　　對照組:造兔顱骨缺損后，緊密縫合骨膜及皮膚，不做任何干預(yù)措施，待其骨缺損自然愈合。術(shù)后第一天開始，每天一次在進食前按1ml/kg定量生理鹽水灌胃;
　　淫羊藿苷組:造兔顱骨缺損后，緊密縫合骨膜及皮膚，淫羊藿苷中藥全身用藥。術(shù)后第一天開始，每天按等劑量淫羊藿

3、苷中藥灌胃;
　　CGF組:造兔顱骨缺損后，制取CGF纖維蛋白凝膠膜覆蓋充填在局部骨缺損處，分層緊密縫合骨膜及皮膚，關(guān)閉創(chuàng)面。
　　2.手術(shù)實驗過程:按照實驗動物分組，10％水合氯醛全麻下手術(shù)造直徑15mm兔顱骨缺損。對照組術(shù)后第一天開始每日按照1ml/kg給予定量生理鹽水灌胃，淫羊藿苷組術(shù)后第一天開始每日給予等劑量淫羊藿苷灌胃，CGF組術(shù)中給予CGF纖維蛋白凝膠膜覆蓋顱骨缺損區(qū)，術(shù)后自由取食水。分別于術(shù)后2周、4周、8周、

4、12周處死動物，無菌條件下切取缺損區(qū)新生組織標本，進行大體觀察并拍攝X線片以觀察顱骨缺損區(qū)愈合情況。
　　3.組織學觀察:骨組織脫礦制作組織切片，進行HE染色、免疫組化，觀察兔顱骨缺損區(qū)骨修復(fù)愈合情況。
　　4.骨計量學觀察:鏡下觀察三種方法對缺損新生組織區(qū)破骨細胞和成骨細胞的數(shù)量和特點的影響，骨小梁平均寬度和面積，以及在不同愈合階段對成骨速度和新生骨質(zhì)量的影響。
　　5.統(tǒng)計分析:采用方差分析各組間骨計量學指標之間差

5、異。P＜0.05時認為具有統(tǒng)計學意義。
　　第二部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進兔顱骨缺損修復(fù)的基因表達譜差異分析
　　1.實驗動物分組，動物實驗，動物給藥同第一部分。
　　2.總RNA提取及純化:三組動物分別于術(shù)后2、4周處死，無菌條件下截取缺損區(qū)新生組織，液氮環(huán)境中研磨，提取并純化總RNA。并測定總RNA濃度、純度及完整性。
　　3.Affymetrix全基因組mRNA表達譜芯片實驗。
　　4.生

6、物信息軟件分析:采用Robust Multichip Analysis（RMA）歸一化方法處理分析，三組間兩兩對比篩選差異基因，選擇上調(diào)大于2倍的基因和下調(diào)大于2倍的基因，并進行代謝途徑pathway分析。
　　第三部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進兔顱骨缺損修復(fù)的主要信號傳導(dǎo)通路的探討
　　1.動物分組，動物實驗同第一部分
　　2.顱骨缺損區(qū)新生組織mRNA提取、純化同第二部分
　　3.將第二部分實驗篩選出

7、的淫羊藿苷組與對照組對比差異基因HGF和CGF組與對照組對比差異基因Runx2上下游引物由上海生工分別合成。
　　4.利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶變性RNA和引物，并加入反應(yīng)液，合成cDNA第一鏈。
　　5.Real-Time PCR，以上述合成cDNA第一鏈為模板，通過Real-Time PCR擴增，以2-(△Ctsample-△Ctcontrol)法進行計算，去檢測淫羊藿苷組與對照組HGF mRNA表達情況、檢測CGF組與對照

8、組Runx2mRNA表達情況。
　　6.提取顱骨缺損區(qū)新生組織蛋白，通過Western blot分析檢測淫羊藿苷組與對照組HGF蛋白表達情況、CGF組與對照組Runx2蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進兔顱骨缺損修復(fù)形態(tài)學觀察
　　1.實驗動物大體觀察。
　　2.X線觀察。
　　3.HE染色觀察。
　　4.骨計量學觀察。
　　5.免疫組織化學檢測BM

9、P-2和TGFβ1蛋白表達結(jié)果。
　　第二部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進兔顱骨缺損修復(fù)的基因表達譜差異分析
　　1.mRNA純度及完整性鑒定
　　對照組，淫羊藿苷組和CGF組RNA的OD260/OD280比值均位于1.9～2.0之間，純度及濃度符合實驗要求。凝膠電泳結(jié)果顯示，對照組，淫羊藿苷組和CGF組RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見三個條帶出現(xiàn)，且第一條帶(28S)亮度約為第二條(18S)亮度的兩倍，各組提取的R

10、NA完整性良好。
　　2.通過PARTEK分析軟件，組間對比差異分析，分別篩選出基因信號上調(diào)和下調(diào)2倍差異的全部基因。
　　2.1.淫羊藿苷組與對照組比較
　　2周，篩選條件2倍差異以上，共出現(xiàn)23個基因表達發(fā)生變化。（10個基因上調(diào)，13個基因下調(diào)）
　　4周，篩選條件2倍差異以上，共出現(xiàn)35個基因表達發(fā)生變化。（10個基因上調(diào)，25個基因下調(diào)）
　　2.2.CGF組與對照組比較
　　2周，篩選條件

11、2倍差異以上，共出現(xiàn)25個基因表達發(fā)生變化。（5個基因上調(diào)，20個基因下調(diào)）
　　4周，篩選條件2倍差異以上，共出現(xiàn)40個基因表達發(fā)生變化。（17個基因上調(diào)，23個基因下調(diào)）
　　2.3.CGF組與淫羊藿苷組比較
　　2周，篩選條件2倍差異以上，共出現(xiàn)20個基因表達發(fā)生變化。（6個基因上調(diào)，14個基因下調(diào)）
　　4周，篩選條件2倍差異以上，出現(xiàn)個42基因表達發(fā)生變化。(5個基因上調(diào)，37個基因下調(diào))
　　3

12、.匯總出前5位上調(diào)與下調(diào)最顯著差異基因，并進行組間比較。其中淫羊藿苷組與對照組比較在2周和4周都出現(xiàn)HGF基因高表達;CGF組與對照組比較在2周和4周都出現(xiàn)Runx2基因高表達;淫羊藿苷組與CGF組比較在2周時出現(xiàn)ZIC5基因高表達，但在4周時未見。
　　4.在Pathway分析中，差異基因共涉及了10條途徑，包括:蛋白消化和吸收（Protein digestion and absorption），5-羥色胺能神經(jīng)突觸（Serot

13、onergic synapse），ECM受體相互作用(ECM-receptorinteraction)，粘著(Focal adhesion)，腫瘤蛋白多糖化(Proteoglycansin cancer)，PI3K-Akt信號途徑(PI3K-Akt signaling pathway)，鈣離子信號途徑(Calcium signaling pathway)，擴張型心肌病(Dilatedcardiomyopathy)，平滑肌收縮（Vascu

14、lar smooth muscle contraction）和神經(jīng)活性的配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptorinteraction)。
　　第三部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進兔顱骨缺損修復(fù)的主要信號傳導(dǎo)通路的探討
　　1.Real-time PCR檢測淫羊藿苷組與對照組HGF的mRNA表達
　　淫羊藿苷組與對照組樣本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行Real-timePCR擴增，

15、可見溶解曲線成單峰曲線，證明引物設(shè)計正確。進行Real-time PCR分析。結(jié)果顯示，淫羊藿苷組HGF的mRNA表達顯著高于對照組。
　　2.Western blot檢測淫羊藿苷組與對照組HGF、p-Akt的蛋白的表達
　　提取淫羊藿苷組與對照組缺損區(qū)新生組織總蛋白進行Westernblot分析。結(jié)果顯示，淫羊藿昔組的HGF蛋白表達顯著高于對照組。淫羊藿苷組p-Akt的蛋白表達顯著高于對照組。
　　3.Real-ti

16、me PCR檢測CGF組與對照組Runx2基因mRNA表達
　　CGF組與對照組樣本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行Real-time PCR擴增，可見溶解曲線成單峰曲線，證明引物設(shè)計正確。進行Real-time PCR分析。結(jié)果顯示，CGF組Runx2的mRNA表達顯著高于對照組。
　　4.Western blot檢測CGF組與對照組Runx2的蛋白的表達
　　提取CGF組與對照組缺損區(qū)新生組織總蛋白進行Western

17、blot分析。結(jié)果顯示，CGF組Runx2蛋白表達水平顯著高于對照組，CGF組ERK的磷酸化水平顯著高于對照組。
　　結(jié)論:
　　1.自體CGF與淫羊藿苷均能夠增加兔顱骨缺損區(qū)成骨骨量，提高愈合質(zhì)量。
　　2.自體CGF與淫羊藿苷均能促進兔顱骨缺損愈合質(zhì)量與速度。
　　3.HGF因子與Runx2因子分別在淫羊藿苷組、CGF組2周、4周均有較顯著上調(diào)表達。
　　4.淫羊藿苷與CGF對顱骨缺損修復(fù)基因表達的影響