胞質內DNA識別蛋白在HBV復制中的作用.pdf

1、目的
　　1、觀察乙型肝炎病毒(HBV)對肝癌細胞系HepG2產(chǎn)生天然免疫應答的影響。
　　2、了解細胞質內的DNA識別受體(AIM2、HMGB1、DAI)對肝癌細胞系HepG2中HBV復制的影響及其可能機制。
　　方法
　　1、用HBV1.3復制型質粒pHY106+wta轉染肝癌細胞系HepG2,分別在既定時間點提取細胞總RNA,RealtimeRT-PCR檢測天然免疫信號分子表達情況。
　　2、用不同濃

2、度AIM2siRNA、HMGB1siRNA、DAIsiRNA與HBV1.3復制型質粒pHY106+wta共同轉染肝癌細胞系HepG2,southernblot檢測細胞內HBV復制中間體;realtimeRT-PCR檢測DAI、HMGB1、AIM2表達情況;ELISA檢測細胞上清中HBsAg與HBeAg的表達情況;并分析對HBV復制所誘導的天然免疫產(chǎn)生的IFIT1、IL-6、MxA表達的影響。
　　3、聯(lián)合阻斷兩個DNAsensor

3、s對HBV復制及蛋白表達的影響。southernblot檢測細胞內HBV復制中間體,ELISA檢測細胞上清中HBsAg與HBeAg的表達情況。
　　4、MTT法檢測siRNA與HBV1.3復制型質粒pHY106+wta共轉后對細胞生長的影響。
　　結果
　　1、HBV1.3復制型質粒pHY106+wta轉染HepG2后可以啟動短暫的天然免疫應答,可以激活DAI、AIM2一過性升高。
　　2、下調DAI、HMGB1

4、的表達后HBV的復制均受到抑制,同時HBsAg和HBeAg的分泌也受到明顯抑制。而AIM2表達下調后HBV復制明顯增強,同時HBsAg和HBeAg的分泌也增多。
　　3、隨著siRNA濃度的升高,AIM2對HBV蛋白分泌的促進作用逐漸降低。而HMGB1、DAI識別蛋白則隨著siRNA濃度的升高,對HBsAg和HBeAg抑制效果越明顯。
　　4、DAI與TBK1同時下調后,HBV蛋白表達受到抑制,表明DAI的抑制作用起主要作用

5、。DAI與AIM2同時下調后,也表現(xiàn)出對HBV蛋白表達的抑制。HMGB1與TBK1同時下調或HMGB1與AIM2同時下調,都表現(xiàn)出對HBV蛋白表達的抑制作用。
　　5、不論下調AIM2、DAI后,對HBV誘導的IFIT1、IL-6、MxA表達沒有影響。但是下調HMGB1后,對HBV誘導的IL-6有影響,對IFIT1沒有顯著影響,表明HMGB1參與了HBV誘導的NF-kB-IL-6信號途徑,沒有參與I型IFN信號途徑。
　　6

6、、AIM2、DAI對HepG2細胞活力沒有明顯影響,而HMGB1影響HepG2活力,對細胞生長有影響。
　　結論
　　1、HBV能夠誘導HepG2細胞產(chǎn)生天然免疫應答。
　　2、DAI和HMGB1可能通過某未知的信號通路參與了HBV復制和蛋白表達過程的調控,與I型干擾素通路無關。
　　3、AIM2也參與了HBV復制和蛋白表達的調節(jié),其對HBV復制影響機制需要進一步研究.
　　本研究的創(chuàng)新點及意義: