siRNA對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用研究.pdf

1、人類(lèi)乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是正嗜肝脫氧核糖核酸(DNA)病毒屬的一個(gè)成員，其基因組是一個(gè)長(zhǎng)約3.2kb的不完全雙鏈環(huán)狀DNA，其長(zhǎng)鏈上有4個(gè)開(kāi)放閱讀框架(open reading frame，ORF)，分別稱(chēng)為S、C、P和X，編碼外膜蛋白、核殼蛋白、聚合酶和X蛋白。HBV雖然是DNA病毒，但在其復(fù)制過(guò)程中存在一個(gè)從前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄到DNA的重要環(huán)節(jié)，病毒一旦進(jìn)入宿主體內(nèi)后，具有雙鏈環(huán)狀的病毒DNA

2、在人體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，病毒長(zhǎng)期持續(xù)的感染，最終導(dǎo)致慢性乙型肝炎的形成，通常情況下，病毒在人體內(nèi)經(jīng)歷數(shù)十年的持續(xù)感染，可導(dǎo)致肝硬化的形成，最終超過(guò)三分之一的肝硬化患者會(huì)直接導(dǎo)致肝癌的生成。 慢性HBV感染的抗病毒治療一直是醫(yī)學(xué)界的重大難題。現(xiàn)臨床上被批準(zhǔn)的用于治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥物主要有拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋等核苷酸類(lèi)似物。在若干年的臨床治療過(guò)程中人們發(fā)現(xiàn)，這些藥物對(duì)乙型肝炎e抗原(hepatitis B e Antige

3、n，HBeAg)的有效清除以及HBV DNA的抑制，都起到了一定的效果，但是在臨床上對(duì)患者長(zhǎng)期的治療過(guò)程中，由于藥物長(zhǎng)期作用，病毒所出現(xiàn)的耐藥性突變亦是我們不可忽視的。病毒耐藥性突變的出現(xiàn)，導(dǎo)致隨后對(duì)病毒的治療效果不佳，這也是臨床上對(duì)慢性HBV感染的抗病毒治療所急需解決的問(wèn)題。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(double stranded RNA，

4、dsRNA)時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。這一現(xiàn)象廣泛存在于自然界各級(jí)生物體當(dāng)中，是生物體清除病毒等外源性核酸或突變及異常表達(dá)內(nèi)源性基因的一種自我保護(hù)機(jī)制。在哺乳動(dòng)物中，短至21-23nt的雙鏈RNA可以作為小干擾RNA分子(small interfering RNAs，siRNA)與Di

5、cer以及其它蛋白因子共同形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC中的siRNA以其反義鏈與互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，置換出正義鏈。雙鏈mRNA被相關(guān)酶識(shí)別，導(dǎo)致整條mRNA鏈被降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了siRNA對(duì)HBV復(fù)制抑制作用的研究，相關(guān)的研究數(shù)據(jù)亦表明了siRNA分子對(duì)降低HBV的基因組相關(guān)被抑制基因的表達(dá)起到了較好的效果。但是絕大多

6、數(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都是針對(duì)HBV基因組中的核心蛋白(core protein，C)、聚合酶蛋白(polymerase protein，P)和表面蛋白(surface protein，S)而言的。HBV X蛋白(X protein，X)是HBV基因組的重要結(jié)構(gòu)部分，通過(guò)以往的研究結(jié)果人們推測(cè)HBX在肝癌的形成過(guò)程中起到了很大的推動(dòng)作用，作為一個(gè)多功能調(diào)節(jié)蛋白而言，HBX通過(guò)與宿主肝細(xì)胞中相關(guān)因子的相互影響，在對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、周期調(diào)控與

7、細(xì)胞凋亡的過(guò)程中均有不同程度的作用。 本研究選用HBX作為作用靶點(diǎn)，采用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行抗HBV感染的嘗試。首先建立了HBV-adr亞型細(xì)胞模型(HepG2.2.15細(xì)胞)，并將所篩選的三條抗HBV的特異siRNA序列導(dǎo)入HepG2.2.15細(xì)胞，通過(guò)real-time RT-PCR分析細(xì)胞中HBx mRNA在抑制后的表達(dá)水平同時(shí)運(yùn)用Western blot檢測(cè)乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface anti