HBV對(duì)補(bǔ)體殺傷作用的影響及LPS對(duì)胞內(nèi)DNA免疫的作用研究.pdf

1、第一部分:HBV及其片段HBc、HBx對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的肝細(xì)胞殺傷作用的影響研究
　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)在感染肝細(xì)胞中極易發(fā)生基因片段的整合從而導(dǎo)致病毒在機(jī)體內(nèi)長期存在不易被清除,如今已經(jīng)成為世界性難題。目前關(guān)于乙肝及其所致肝癌的發(fā)病機(jī)制還不是很明確。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明,HBV全基因,HBx,PreS2均可提高肝細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。另已有研究證實(shí),補(bǔ)體系統(tǒng)在保護(hù)機(jī)體抵抗病毒感染

2、中發(fā)揮重要作用,急性期補(bǔ)體成分C3、C4的胞漿水平與患者疾病的轉(zhuǎn)歸有著密切的聯(lián)系。
　　 補(bǔ)體系統(tǒng)由約30種可溶性及膜結(jié)合型蛋白組成,其中近90％的胞漿補(bǔ)體成分及可溶性的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白都是在肝臟(主要是肝細(xì)胞)中合成的。生理?xiàng)l件下,所有的補(bǔ)體成分處于自發(fā)地低水平活化狀態(tài),體內(nèi)的這種活化對(duì)機(jī)體細(xì)胞形成潛在的威脅。然而,機(jī)體細(xì)胞可表達(dá)數(shù)種能夠抑制自身補(bǔ)體活化從而保護(hù)自身的胞漿和膜蛋白,目前已知至少有10種可溶性和膜結(jié)合型蛋白。人類肝細(xì)

3、胞表達(dá)CD59,CD55,CD46和CFH,其中CD55,CD46和CFH都通過限制C3活化發(fā)揮作用,而CD59則通過抑制MAC形成起作用；阻斷CD59可顯著提高補(bǔ)體對(duì)肝細(xì)胞的殺傷率,而阻斷CD55,CD46,CFH作用不明顯。因此CD59被認(rèn)為是肝細(xì)胞中最重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白。于是我們提出一個(gè)問題:HBV對(duì)補(bǔ)體殺傷感染肝細(xì)胞的活性有何影響?其作用機(jī)制是什么?HBV片段HBc、HBx是否參與補(bǔ)體殺傷作用的調(diào)節(jié)?
　　 目的:

4、>　　 1.探討HBV感染對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用的影響及其機(jī)制。
　　 2.探討HBV片段HBc、HBx誘導(dǎo)對(duì)補(bǔ)體殺傷的影響。
　　 方法:
　　 1.高通量分析HBV感染對(duì)肝細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響
　　 1.1 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠基因芯片分析
　　 1.2 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 2.HBV表達(dá)對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的肝細(xì)胞殺傷的影響
　　 2.1表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞模型的建立

5、
　　 2.2HBV表達(dá)對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的肝細(xì)胞殺傷的影響
　　 2.3 HBV感染對(duì)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59表達(dá)的影響
　　 2.4 CD59在補(bǔ)體殺傷HBV感染細(xì)胞中的作用
　　 3.HBV片段HBc、HBx表達(dá)對(duì)補(bǔ)體殺傷的影響
　　 3.1表達(dá)HBc、HBx的肝癌細(xì)胞模型的建立
　　 3.2 HBc、HBx表達(dá)對(duì)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59表達(dá)的影響
　　 3.3 HBc、HBx表達(dá)對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)

6、的肝細(xì)胞殺傷的影響及機(jī)制
　　 3.3 CD59蛋白水平表達(dá)的調(diào)控機(jī)制
　　 結(jié)果:
　　 1.HBV表達(dá)明顯改變補(bǔ)體成分的表達(dá)
　　 2.HBV表達(dá)對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的肝細(xì)胞殺傷的影響
　　 3.HBV片段HBc和HBx對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的肝細(xì)胞殺傷作用的影響
　　 結(jié)論:
　　 1.HBV表達(dá)可明顯改變補(bǔ)體系統(tǒng)的表達(dá)譜,對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)控可能是HBV致病的機(jī)制之一。
　　 2.HBV表達(dá)

7、可提高肝細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體殺傷的敏感性,證實(shí)HBV具有促進(jìn)補(bǔ)體殺傷的生物學(xué)活性。
　　 3.HBV感染可在RNA和蛋白水平抑制肝細(xì)胞內(nèi)CD59的表達(dá)。
　　 4.HBV表達(dá)提高肝細(xì)胞殺傷敏感性這一作用主要是通過下調(diào)CD59而發(fā)揮的。
　　 5.HBV片段HBc可在蛋白水平抑制肝細(xì)胞內(nèi)CD59表達(dá)并進(jìn)而提高細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體殺傷的敏感性,可能是HBV發(fā)揮作用的一個(gè)關(guān)鍵片段。
　　 6.HBx對(duì)CD59和補(bǔ)體殺傷活性均無顯著

8、影響。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)及意義:
　　 1.本研究首次結(jié)合高通量分析的方法對(duì)HBV影響的基因表達(dá)譜尤其是補(bǔ)體基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析,有利于從總體上理解HBV的作用。
　　 2.本研究通過HBV表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同肝細(xì)胞系,首次發(fā)現(xiàn)HBV表達(dá)可提高肝細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體殺傷的敏感性,為進(jìn)一步闡明HBV感染相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 3.本研究分別利用HBV感染的細(xì)胞模型、動(dòng)物模型和臨床標(biāo)本檢測了CD59的表達(dá)水平,

9、首次發(fā)現(xiàn)HBV感染可下調(diào)CD59表達(dá),為研究補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在HBV感染中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.應(yīng)用抗體阻斷CD59作用的方法,首次證實(shí)HBV提高補(bǔ)體殺傷敏感性的作用是通過下調(diào)CD59表達(dá)發(fā)揮的。闡明了HBV影響補(bǔ)體作用的機(jī)制,為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 5.在研究HBV全基因?qū)ρa(bǔ)體殺傷功能影響的基礎(chǔ)上,本研究又深入探討了HBV片段HBc和HBx對(duì)補(bǔ)體功能的作用,初步篩選了HBV影響補(bǔ)體殺傷的關(guān)鍵片段。
　

10、　 第二部分:LPS預(yù)處理對(duì)胞內(nèi)DNA免疫的影響
　　 固有免疫系統(tǒng)通過模式識(shí)別受體來識(shí)別病原體感染,從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。病原體刺激主要分為兩類:一類是病原體特異性產(chǎn)物,如LPS,LTA等；第二類包括病原體核酸。已知部分TLRs可以識(shí)別核酸,如TLR3識(shí)別單鏈RNA,TLR9識(shí)別CpC。最近研究發(fā)現(xiàn)胞漿雙鏈DNA可以不依賴于TLR而引起機(jī)體的免疫應(yīng)答,其受體尚不明確(可能為DAI或其他分子),進(jìn)入細(xì)胞后可以激活TANK結(jié)合激酶(

11、TBK1),進(jìn)而活化IRF3,促進(jìn)Ⅰ型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生并分泌大量干擾素。
　　 LPS是革蘭氏陰性菌表面的一種脂多糖,能被固有免疫細(xì)胞表面的TLR4識(shí)別,分別經(jīng)MyD88依賴途徑活化NF-κB,經(jīng)MyD88非依賴途徑即TRIF途徑活化IRF3和NF-κB,從而產(chǎn)生大量細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素。當(dāng)給予細(xì)胞兩次LPS后,其分泌的細(xì)胞因子和干擾素顯著降低,稱為LPS耐受。在LPS耐受時(shí),并非所有基因均被抑制,部分基因甚至表達(dá)更強(qiáng)。應(yīng)

12、答受抑制的現(xiàn)象也出現(xiàn)在當(dāng)LPS與其他TLR的刺激物先后作用時(shí),稱為交叉耐受。那么LPS對(duì)DNA免疫的影響又是如何呢??作用機(jī)制又是什么?其作用是否與LPS耐受一致從這幾個(gè)問題出發(fā),我們研究了LPS對(duì)DNA免疫的影響,并取得了一定的研究成果。
　　 目的:
　　 探討LPS預(yù)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA免疫的影響及其機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.LPS預(yù)處理對(duì)胞內(nèi)B-DNA免疫產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素的影響
　　

13、1.1 LPS預(yù)處理對(duì)化學(xué)合成DNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的影響LPS預(yù)處理對(duì)DNA轉(zhuǎn)染效率的影響
　　 1.2 LPS預(yù)處理對(duì)細(xì)菌DNA感染誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的影響
　　 1)LPS預(yù)處理對(duì)細(xì)菌轉(zhuǎn)染效率的影響
　　 實(shí)時(shí)定量PCR:LPS預(yù)處理RAW264.7后24h后,按照MOI為6:1加入LM,4h后提取基因組DNA,實(shí)時(shí)定量PCR檢測細(xì)菌基因組與細(xì)胞基因組的相對(duì)量。
　　 流式細(xì)胞術(shù):LPS預(yù)

14、處理RAW264.7后24h后,按照MOI為6:1加入GFP-LM,4h后充分洗滌細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性細(xì)胞比例。
　　 2)LM感染RAW264.7
　　 按照MOI為6:1感染經(jīng)或不經(jīng)LPS預(yù)處理的RAW264.7細(xì)胞4h后,提取RNA,實(shí)時(shí)定量PCR檢測Ifnb1的表達(dá)。
　　 2.LPS預(yù)處理影響B(tài)-DNA免疫的機(jī)制
　　 2.1基因轉(zhuǎn)錄水平
　　 建立熒光報(bào)告系統(tǒng),將含有Ifnb

15、1啟動(dòng)子的熒光報(bào)告載體轉(zhuǎn)染HEK293-TLR4細(xì)胞,24h后,以LPS刺激該細(xì)胞,再24h后,轉(zhuǎn)染10μg/ml DNA,20h后雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。
　　 2.2細(xì)胞通路水平
　　 以LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24h后,再轉(zhuǎn)染DNA,于不同時(shí)間點(diǎn)分別提取蛋白,Western Blot檢測IκB,cJun,IRF3磷酸化情況。以cJun上游分子JNK的特異性抑制物SP600125和IκB通路的抑制物BA

16、Y7082阻斷cJun和NF-κB活化,實(shí)時(shí)定量PCR檢測Ifnb1表達(dá)。
　　 3.LPS預(yù)處理對(duì)DNA誘導(dǎo)基因表達(dá)譜的影響
　　 以LPS刺激BMDM細(xì)胞24h后,再轉(zhuǎn)染DNA,4h后提取RNA,質(zhì)檢合格后進(jìn)行基因芯片檢測,對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行分析驗(yàn)證及機(jī)制探討。
　　 結(jié)果:
　　 1.LPS預(yù)處理對(duì)胞內(nèi)DNA產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素的影響
　　 2.LPS預(yù)處理抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的機(jī)制
　　 3

17、.LPS預(yù)處理對(duì)DNA誘導(dǎo)基因表達(dá)譜的影響
　　 結(jié)論:
　　 1.LPS預(yù)處理可顯著的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,說明TLR4通路的改變會(huì)影響到DNA免疫的水平。
　　 2.LPS可通過抑制DNA誘導(dǎo)的Ifnb1的啟動(dòng)子活性而抑制其表達(dá),從通路上主要是抑制轉(zhuǎn)錄因子IRF3和cJun而非IκB的磷酸化而實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.LPS預(yù)處理并非抑制DNA免疫誘導(dǎo)的所有基因表達(dá),部分基因甚至表達(dá)明顯上調(diào),這與LPS-LPS

18、耐受類似,但其表達(dá)譜又存在差別,說明其調(diào)控機(jī)制仍存在差別。
　　 4.LPS-DNA免疫所誘導(dǎo)的耐受基因受到IRF、Stat1等的調(diào)控,負(fù)性調(diào)控因子SOCS1的上調(diào)也是因?yàn)橹弧?br>　　 創(chuàng)新點(diǎn)及意義:
　　 1.本研究首次探討了LPS對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA免疫的影響,有助于解釋臨床復(fù)合性感染的發(fā)病機(jī)制,并對(duì)于感染性疾病的治療,DNA疫苗的應(yīng)用等均具有重要意義。
　　 2.首次從啟動(dòng)子活性,轉(zhuǎn)錄因子水平及信號(hào)通路上