基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在基因定點(diǎn)修復(fù)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、基因治療是目前治愈人類疾病的最根本方法，但因載體安全性差等問題，其臨床應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制。要解決這些問題，首先就是要提高治療的靶向性，其中最徹底的方法就是原位修復(fù)有缺陷的基因，即基因定點(diǎn)修復(fù)，它在靶向性、安全性及操作的方便性方面與基因治療其它方法相比有明顯的優(yōu)勢(shì)。目前最有希望的定點(diǎn)修復(fù)載體是單鏈寡核苷酸(singlestrandedoligonucleotide，SSO)。以往的工作證實(shí)，SSO確有在多系統(tǒng)多層次上完成基因定點(diǎn)修復(fù)的能力

2、。但它的主要缺點(diǎn)是修復(fù)效率較低，限制了進(jìn)一步的應(yīng)用研究。要想提高其修復(fù)效率，當(dāng)務(wù)之急就是揭示SSO介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修復(fù)的作用機(jī)制。 本組已經(jīng)構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞定點(diǎn)修復(fù)的熒光報(bào)告系統(tǒng)(F5細(xì)胞)，并已篩選出了最佳打靶分子(E6)及最佳轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)把Thymidine作用于F5細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)修復(fù)效率顯著提高，因此提出了復(fù)制叉滲漏，SSO摻入假說(shuō)。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制是兩個(gè)密切聯(lián)系的過程，盡管轉(zhuǎn)錄相關(guān)機(jī)制研究已取得一定進(jìn)展，但這些工作都是通過在全基

3、因組范圍內(nèi)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性而完成的。在這種全局性的調(diào)控方式下，最終修復(fù)效率的變化是由多種因素改變引起的，不利于進(jìn)行機(jī)制探討。因此本實(shí)驗(yàn)中我們采用了一種特異性的調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的策略，即以靶基因?yàn)槟０澹铣尚蛄刑禺愋缘妮o助寡核苷酸。因每一條輔助寡核苷酸都可與靶基因上某段特定區(qū)域的DNA雙鏈中的一條鏈互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而在這個(gè)特定的區(qū)域內(nèi)形成一個(gè)loop結(jié)構(gòu)。Loop結(jié)構(gòu)形成后，必然會(huì)影響到靶基因的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制過程，進(jìn)而導(dǎo)致修復(fù)效率的改變。我們選擇了10

4、0nt長(zhǎng)和25nt長(zhǎng)兩種長(zhǎng)度的輔助寡核苷酸分別與E6一起進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩組實(shí)驗(yàn)的修復(fù)效率都有提高。然后，我們把兩段25nt長(zhǎng)的輔助寡核苷酸作為一個(gè)組合，并采用兩步轉(zhuǎn)染法進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)，效率提高至對(duì)照組的5倍。我們還比較了互補(bǔ)的輔助寡核苷酸的修復(fù)效率，結(jié)果顯示兩組的修復(fù)效率基本持平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均支持我們?cè)O(shè)計(jì)輔助寡核苷酸的初步設(shè)想，即通過形成loop結(jié)構(gòu)，調(diào)解靶基因的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制過程，進(jìn)而改變修復(fù)效率。把thymidine和輔助寡核苷酸共

5、同作用于F5細(xì)胞后，結(jié)果提示最終的修復(fù)效率和只用thymidine時(shí)的效率基本持平，以這個(gè)結(jié)果為基礎(chǔ)，我們提出了轉(zhuǎn)錄復(fù)制偶聯(lián)的修復(fù)機(jī)制。 丁酸鈉作用于F5細(xì)胞，修復(fù)效率比對(duì)照組提高了3倍。當(dāng)把丁酸鈉與輔助寡核苷酸共同作用于F5細(xì)胞中，結(jié)果顯示修復(fù)效率比只用輔助寡核苷酸的實(shí)驗(yàn)組低。針對(duì)此結(jié)果，我們認(rèn)為丁酸鈉即可開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，又可加快轉(zhuǎn)錄速度的特點(diǎn)對(duì)定點(diǎn)修復(fù)過程既有利又有弊。 本實(shí)驗(yàn)中，定點(diǎn)修復(fù)過程依舊表現(xiàn)出明顯的鏈偏向性