中國(guó)人群中TRAC基因與IgA腎病相關(guān)關(guān)系的研究和一個(gè)局限性股骨頭-髖關(guān)節(jié)病變家系的研究.pdf

1、IgA腎病是世界范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。在中國(guó)人群中，IgA腎病占原發(fā)性腎小球腎炎的35％-45％。IgA腎病最初被認(rèn)為是一種由體液免疫異常引起的疾病，但是越來(lái)越多的研究表明細(xì)胞免疫異常與IgA腎病的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)。這包括輔助性T淋巴細(xì)胞的功能亢進(jìn)，抑制性T淋巴細(xì)胞的功能缺陷和數(shù)目減少，T細(xì)胞對(duì)IgA分泌的調(diào)控異常，T細(xì)胞某些細(xì)胞因子如IL-2，IFN-γ等分泌過(guò)多，以及在受累腎臟出現(xiàn)T細(xì)胞滲

2、透等。T細(xì)胞受體在識(shí)別MHC結(jié)合的抗原和IgA的產(chǎn)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。T cell receptor alpha constant(TRAC)為T細(xì)胞受體alpha鏈恒定區(qū)編碼。已有的TRAC基因與IgA腎病相關(guān)關(guān)系研究的報(bào)道分別來(lái)自日本和香港人群，這兩項(xiàng)研究樣本量小，均使用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的技術(shù)，并且得到了相反的結(jié)論。因此，本研究對(duì)TRAC基因與IgA腎病的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究：首先對(duì)TRAC基因進(jìn)行重測(cè)序，然后構(gòu)建覆蓋

3、整個(gè)基因區(qū)域的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)(LDblocks)及每個(gè)單倍型域中單倍型的組成，并進(jìn)行大樣本量病例一對(duì)照(704例病例-704例對(duì)照)和基于家庭(310個(gè)家庭)的關(guān)聯(lián)分析。研究結(jié)果顯示，TRAC基因的確處于基因組的重組熱區(qū)，在6.9kb的基因組節(jié)段中包含了9個(gè)單倍型域。在第1內(nèi)含子，有6個(gè)SNPs(SNP 3-8)集中于一段僅85個(gè)堿基長(zhǎng)度的DNA片段中，位于一段高度可變區(qū)。本研究首先在704例病例和704例相匹配的對(duì)照組中進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析

4、。單個(gè)位點(diǎn)分析顯示，SNP 1-2(位于5’側(cè)翼區(qū)，LD block 1)和SNP 3-8(位于第1內(nèi)含子高度可變區(qū)，LD block 2)，這8個(gè)SNPs均與IgA腎病相關(guān)(P=0.0205-0.0000037)。單倍型分析顯示，單倍型1(由SNP 1-2構(gòu)成，位于LD block 1)和單倍型3(由SNP 3-8構(gòu)成，位于LD block 2)在病例組的出現(xiàn)頻率顯著偏高，而位于相應(yīng)LD blocks中的單倍型2和4在病例組的出現(xiàn)頻率

5、偏低；由SNP 1和2所構(gòu)建的單倍型，及由SNP 3-8所構(gòu)建的單倍型整體上均與IgA腎病相關(guān)(Globle P值分別為3.3×10-16和1.6×10-16)。為了驗(yàn)證以上結(jié)果，我們將704例IgA腎病病人分為兩組相互獨(dú)立的樣本然后分別進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析：一組為310個(gè)IgA腎病家庭，另一組為394例病例和394例相匹配的對(duì)照組。基于家庭的分析采用傳遞不平衡檢驗(yàn)(transmission disequilibrium test，TDT)，對(duì)

6、病例一對(duì)照組的分析采用卡方檢驗(yàn)和邏輯回歸分析?；诩彝サ膯挝稽c(diǎn)分析顯示，8個(gè)SNPs(SNP 1-8)都與IgA腎病相關(guān)(P=0.0136-0.0022)。單倍型分析顯示，單倍型1和3在家庭中過(guò)多傳遞給患者，P值分別為0.0011和0.0063；相反地，單倍型2和4在家庭中過(guò)少傳遞給患者，P值分別為0.0531和0.0040。在394例病例和394例對(duì)照組中，SNP 1-6與IgA腎病顯著相關(guān)(P=0.0176-0.0002)；由SNP

7、 1和2所構(gòu)建的單倍型，及由SNP3-8所構(gòu)建的單倍型整體上均與IgA腎病相關(guān)(Globle P值分別為2.2×10-9和1.2×10-9)。本研究進(jìn)一步對(duì)這4種相關(guān)單倍型進(jìn)行了功能學(xué)檢驗(yàn)。由于它們位于基因的5’端，因此分別通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄活性，及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA豐度。結(jié)果顯示，危險(xiǎn)性單倍型的轉(zhuǎn)錄活性比保護(hù)性單倍型低3.7倍(P<0.001)；攜帶危險(xiǎn)性單倍型個(gè)體的mRNA表達(dá)量比保護(hù)性單倍型低2倍(P<0.00

8、1)。本研究在中國(guó)人群中為TRAC基因與IgA腎病的易感性相關(guān)提供了有力證據(jù)。骨性關(guān)節(jié)炎(OA)的特征性表現(xiàn)是關(guān)節(jié)軟骨退行性病變；股骨頭缺血性壞死(ANFH)是由股骨頭血供不足而引起；小兒股骨頭壞死(Legg-Calvé-Perthesdisease，LCPD)是成長(zhǎng)期兒童中的一種股骨頭缺血性壞死。這三種疾病被認(rèn)為屬于不同的疾病實(shí)體。COL2A1基因編碼Ⅱ型膠原蛋白alpha 1鏈前體，Ⅱ型膠原蛋白是軟骨中最為豐富的成分。COL2A1的

9、p．Gly1170Ser突變已在兩個(gè)臺(tái)灣ANFH家系和一個(gè)日本LCPD家系中報(bào)道。本研究在一個(gè)含五代人42個(gè)成員的大家系中，鑒定了16個(gè)臨床表現(xiàn)有局限性股骨頭/髖關(guān)節(jié)病變的患者。通過(guò)詳細(xì)地臨床、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查，對(duì)這一個(gè)家系中的不同患者確診了三種疾病表型：早發(fā)性髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，股骨頭缺血性壞死及小兒股骨頭壞死。本研究選用了COL2A1基因所在基因組節(jié)段的三個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了連鎖分析，當(dāng)外顯率為年齡依賴性時(shí)，在D12S1663和D12

10、S85的最大LOD值分別為3.91、4.71(重組率為0)，在D12S368的最大LOD值為5.89(重組率為0.05)；當(dāng)外顯率為100％時(shí)，相應(yīng)的LOD值分別為4.21，5.45和6.78。獲得陽(yáng)性LOD值后，即通過(guò)直接測(cè)序?qū)OL2A1基因的所有外顯子及外顯子一內(nèi)含子交界區(qū)進(jìn)行突變篩查。本研究在第50外顯子鑒定了一個(gè)3665G→A的突變，該突變出現(xiàn)于家系所有病人中，但在50個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的健康對(duì)照和家系正常人中闕如(除了IV-10，

11、目前僅8歲，攜帶突變，但尚無(wú)臨床表現(xiàn))，即該突變與三種疾病表型在家系中呈共分離。生物信息學(xué)分析顯示，突變所引起蛋白質(zhì)水平的改變，在isoform 2導(dǎo)致p．Gly1170Ser，在isoform 1導(dǎo)致p．Gly1101Ser。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該突變不會(huì)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)或已知結(jié)構(gòu)域的改變；但在三級(jí)結(jié)構(gòu)中，當(dāng)絲氨酸取代甘氨酸后，蛋白質(zhì)的局部結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)松散的超螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)詳細(xì)的臨床資料分析，本研究發(fā)現(xiàn)不同的疾病表型與發(fā)