細胞外ATP對周圍神經(jīng)損傷后脊髓神經(jīng)元作用及機制的實驗研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷后軸突的再生是實現(xiàn)功能恢復的前提。因此，認清神經(jīng)元在軸突損傷后的病理變化過程具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)一系列的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophicfactors，NTF)、神神經(jīng)遞質和激素等在神經(jīng)生長、發(fā)育、細胞增殖、凋亡、再生等過程中起重要作用。脊髓神經(jīng)元和雪旺細胞表面P2Y受體亞型的存在及其介導的神經(jīng)細胞的電生理變化和細胞增殖，證明細胞外ATP可以保護受損的神經(jīng)元，這種作用是通過P2Y受體介導的。近來發(fā)現(xiàn)：Na+-K+-A

2、TPase不僅具有離子泵的功能，還具有信號轉導分子的作用。細胞內Ca2+離子作為一種重要的信號分子，參與細胞內多種生理生化反應。肌漿網(wǎng)豐富的Ca2+-ATPase對細胞內Ca2+平衡起著重要作用。本實驗主要分為以下三部分。 第一部分細胞外ATP對坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元和靶肌肉ATPase活性影響的研究 目的：了解細胞外ATP對坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌和相應脊髓節(jié)段ATPase活性的影響。方法：成年SD大鼠105只，

3、隨機分成三組，A組為損傷組：右側坐骨神經(jīng)損傷后靶肌肉局部注射生理鹽水組，B組為對照組：右側坐骨神經(jīng)損傷后立即修復并靶肌肉局部注射生理鹽水組；C組為實驗組：右側坐骨神經(jīng)損傷后立即修復并靶肌肉局部注射0.5mgATP組。術后分別于12h、1d、3d、7d、14d、28d、56d測定腓腸肌和L4-6水平脊髓前角運動神經(jīng)元Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活性和相應時期的肌濕重變化情況。結果：細胞外ATP與修復神經(jīng)后能顯著改善A

4、TPase的活性，這種改變與肌濕重的變化相一致，與損傷組和對照組對比有顯著差異(P＜0.05)。結論：細胞外ATP可以通過對ATPase的影響對失神經(jīng)骨骼肌和脊髓前角運動神經(jīng)元具有一定的保護和促進功能恢復作用。 第二部分坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元的變化及細胞外ATP對其作用的實驗研究 目的：探討大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，對應神經(jīng)元的變化轉歸以及局部注射ATP后對脊髓神經(jīng)元這種變化的影響及其方式。方法：成年SD大鼠210只

5、，隨機分成三組，A組為損傷組：選擇右坐骨神經(jīng)損傷后靶肌肉局部注射生理鹽水組，B組為對照組：右側坐骨神經(jīng)損傷后立即修復并靶肌肉局部注射生理鹽水組；C組為實驗組：右側坐骨神經(jīng)損傷后立即修復并靶肌肉局部注射0.5mgATP組。術后分別于12h、1d、3d、7d、14d、28d、56d通過免疫組織化學和WesternBlot技術檢測神經(jīng)元結構及p-GSK-3β(ser9)表達變化情況，評價神經(jīng)損傷后對應脊髓神經(jīng)元的變化及ATP對這種變化的影響作

6、用。結果：坐骨神經(jīng)損傷后對應脊髓神經(jīng)元發(fā)生以凋亡為主的變化，細胞外ATP與修復神經(jīng)后能顯著改善凋亡的發(fā)生并能對GSK-3β的活性產生影響。結論：周圍神經(jīng)損傷后脊髓神經(jīng)元發(fā)生凋亡，局部注射ATP可以起到保護神經(jīng)元的作用，這種作用與GSK-3β有關。 第三部分細胞外ATP對體外培養(yǎng)的機械損傷的脊髓前角運動神經(jīng)元作用機制的實驗研究 目的：研究細胞外ATP對體外培養(yǎng)的機械損傷的脊髓前角運動神經(jīng)元的作用機制。方法：取新生大鼠脊髓，

7、通過常規(guī)的原代細胞培養(yǎng)程序，采用差速貼壁法分離出大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元，培養(yǎng)成熟后制作神經(jīng)元機械損傷體外模型，分為A組：對照組、B組：100μMATP組、C組：100μMATP+20μg/mlSuramin組和D組：100μMATP+10μMOuabain+10μg/mlThapsigargin組，對各組機械損傷的運動神經(jīng)元進行培養(yǎng)，1天后分別進行運動神經(jīng)元計數(shù)、MTT比色實驗觀察運動神經(jīng)元的存活及活性、流式細胞儀分析機械損傷的脊髓前角

8、運動神經(jīng)元凋亡百分率和WersternBlot技術檢測p-GSK-3β(ser9)的表達。結果：A組機械損傷的神經(jīng)元在培養(yǎng)1天后，運動神經(jīng)元計數(shù)和神經(jīng)元存活及活性值最低，與D組相比沒有顯著差異，但是與B組和C組差異顯著；其凋亡細胞百分率最高，與其它三組相比有顯著差異。B組運動神經(jīng)元計數(shù)及MTT比色實驗結果最高，與C組相比差異并不顯著，但是與A組和D組有明顯差異；其神經(jīng)元凋亡百分率最低，與其它三組相比其結果有顯著差異性；C組凋亡細胞百分率

9、與其它三組有明顯差異，但其結果優(yōu)于A組差于其它兩組；其活細胞數(shù)與B組差異不大，明顯優(yōu)于A組和D組。D組神經(jīng)元凋亡百分率明顯低于A組，與B組和C組相比沒有顯著差異，但是其存活細胞數(shù)與B組和C組存在顯著差異，與A組差異不大。 第一部分 細胞外ATP對坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元和靶肌肉ATPase活性影響的研究 目的：了解細胞外ATP對坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌和相應脊髓節(jié)段ATPase活性的影響。方法：成年SD大鼠1

10、05只，隨機分成三組，A組為損傷組：右側坐骨神經(jīng)損傷后靶肌肉局部注射生理鹽水組，B組為對照組：右側坐骨神經(jīng)損傷后立即修復并靶肌肉局部注射生理鹽水組；C組為實驗組：右側坐骨神經(jīng)損傷后立即修復并靶肌肉局部注射0.5mgATP組。術后分別于12h、1d、3d、7d、14d、28d、56d測定腓腸肌和L4-6水平脊髓前角運動神經(jīng)元Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活性和相應時期的肌濕重變化情況。結果細胞外ATP與修復神經(jīng)后能顯著

11、改善ATPase的活性，這種改變與肌濕重的變化相一致，與損傷組和對照組對比有顯著差異(P＜0.05)。結論：細胞外ATP可以通過對ATPase的影響對失神經(jīng)骨骼肌和脊髓前角運動神經(jīng)元具有一定的保護和促進功能恢復作用。 第二部分 坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元的變化及細胞外ATP對其作用的實驗研究 目的：探討大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，對應神經(jīng)元的變化轉歸以及局部注射ATP后對脊髓神經(jīng)元這種變化的影響及其方式。方法：成年

12、SD大鼠210只，隨機分成三組，A組為損傷組：選擇右坐骨神經(jīng)損傷后靶肌肉局部注射生理鹽水組，B組為對照組：右側坐骨神經(jīng)損傷后立即修復并靶肌肉局部注射生理鹽水組；C組為實驗組：右側坐骨神經(jīng)損傷后立即修復并靶肌肉局部注射0.5mgATP組。術后分別于12h、1d、3d、7d、14d、28d、56d通過免疫組織化學和WesternBlot技術檢測神經(jīng)元結構及GSK-3β表達變化情況，評價神經(jīng)損傷后對應脊髓神經(jīng)元的變化及ATP對這種變化的影響作

13、用。結果：坐骨神經(jīng)損傷后對應脊髓神經(jīng)元發(fā)生以凋亡為主的變化，細胞外ATP與修復神經(jīng)后能顯著改善凋亡的發(fā)生并能對GSK-3β的活性產生影響。結論：周圍神經(jīng)損傷后脊髓神經(jīng)元發(fā)生凋亡，局部注射ATP可以起到保護神經(jīng)元的作用，這種作用與GSK-3β有關。 第三部分 細胞外ATP對體外培養(yǎng)的機械損傷的脊髓前角運動神經(jīng)元作用機制的實驗研究 目的：研究細胞外ATP對體外培養(yǎng)的機械損傷的脊髓前角運動神經(jīng)元的作用機制。方法：取新生

14、大鼠脊髓，通過常規(guī)的原代細胞培養(yǎng)程序，采用差速貼壁法分離出大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元，培養(yǎng)成熟后制作神經(jīng)元機械損傷體外模型，分為A組：對照組、B組：100μMATP組、C組：100μMATP+20μg/mlsuramin組和D組：100μMATP+10μMouabain+10μg/mlThapsigargin組，對各組機械損傷的運動神經(jīng)元進行培養(yǎng)，1天后分別進行運動神經(jīng)元計數(shù)、MTT比色實驗觀察運動神經(jīng)元的存活及活性、流式細胞儀分析機械損傷

15、的脊髓前角運動神經(jīng)元凋亡百分率和WesternBlot技術檢測p-GSK-3β(ser9)的表達。結果A組機械損傷的神經(jīng)元在培養(yǎng)1天后，運動神經(jīng)元計數(shù)和神經(jīng)元存活及活性值最低，與D組相比沒有顯著差異，但是與A組和C組差異顯著；其凋亡細胞百分率最高，與其它三組相比有顯著差異。B組運動神經(jīng)元計數(shù)及MTT比色實驗結果最高，與C組相比差異并不顯著，但是與A組和D組有明顯差異；其神經(jīng)元凋亡百分率最低，與其它三組相比其結果有顯著差異性；C組凋亡細胞

16、百分率與其它三組有明顯差異，但其結果優(yōu)于A組差于其它兩組；其活細胞數(shù)與B組差異不大，明顯優(yōu)于A組和D組。D組神經(jīng)元凋亡百分率明顯低于A組，與B組和C組相比沒有顯著差異，但是其存活細胞數(shù)與B組和C組存在顯著差異，與A組差異不大。 綜述 Na+-K+-ATP酶介導的信號傳導：從蛋白質的相互作用到細胞功能 Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)又稱為Na+泵，是P型ATPase超家族成員。除了具有轉運離子

17、的功能之外，Na+-K+-ATPase還能影響細胞內蛋白之間的相互作用起到傳導信號的作用。酶的這種作用主要是通過與蛋白和配體的特異性結合形成復合物來發(fā)揮的。在多種細胞的細胞膜上都存在Na+-K+-ATPase和與之相關的蛋白分子的結合部位，稱為內陷小窩。在對心肌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，當哇巴因與Na+-K+-ATPase結合后，可以激活胞質內的酪氨酸激酶，使細胞內蛋白磷酸化，成為不同作用的信號分子。這種有序的蛋白激酶激活級聯(lián)與促有絲分裂蛋白激