脂多糖對脊髓前角運動神經(jīng)元的損傷作用及機制探討.pdf

1、肌萎縮側索硬化(ALS)是選擇性侵犯上、下運動神經(jīng)元的慢性進行性變性疾病。目前ALS的病因及發(fā)病機制尚不十分清楚，推測有以下幾種：線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)異常聚集、興奮毒作用、軸漿運輸障礙、氧化應激、生長因子缺乏和炎癥等。各種發(fā)病因素并非獨立存在，而是相互作用、相互影響，共同參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來越來越多的證據(jù)顯示，運動神經(jīng)元的選擇性丟失并非細胞自主性的(non-cell-autonomous)，膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)及炎癥反應在ALS

2、的疾病進程中發(fā)揮著關鍵作用。 脊髓器官型培養(yǎng)保留有完整的脊髓水平組織結構和細胞間突觸聯(lián)系，較單細胞培養(yǎng)更接近在體生理環(huán)境，且運動神經(jīng)元能夠穩(wěn)定存活較長時間，為研究ALS等慢性疾病提供了重要的技術手段。脂多糖(LPS)通過Toll樣受體，激活機體的天然免疫系統(tǒng)(在CNS主要是小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞)，引起炎癥反應。因此本研究應用LPS，利用器官型脊髓薄片培養(yǎng)技術建立了炎癥介導的運動神經(jīng)元損傷的體外模型，并以此模型為基礎，深入探討

3、了運動神經(jīng)元的損傷機制。課題研究分三部分：第一部分利用脊髓器官型培養(yǎng)，加入合適濃度的LPS，誘導炎癥反應，建立運動神經(jīng)元相對選擇性受損的體外培養(yǎng)模型，并對運動神經(jīng)元的易受損性進行了分析；第二部分以此模型為基礎，利用RT-PCR、免疫印跡等方法，研究了NADPH氧化酶在其中的變化規(guī)律，并應用相應的抑制劑apocynin證實了NADPH氧化酶在LPS誘導的運動神經(jīng)元損傷中的關鍵作用；第三部分利用分子生物學等技術，證實LPS干預后可引起該培養(yǎng)

4、體系中誘導型NOS(iNOS)和神經(jīng)型NOS(nNOS)活性增加、NO生成增多，進一步應用NOS選擇性和非選擇性抑制劑均未能有效對抗運動神經(jīng)元損傷，提示在該模型體系中，NO可能并未對運動神經(jīng)元損傷起著決定性作用。 一、脂多糖誘導的脊髓前角運動神經(jīng)元損傷及其易感性研究 目的：利用脊髓器官型培養(yǎng)，觀察LPS能否誘導該體系炎癥反應的發(fā)生，尋找合適的劑量建立運動神經(jīng)元相對選擇性受損的體外培養(yǎng)模型，探討運動神經(jīng)元易感性的可能原因。

5、 方法：選用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓組織切片進行體外培養(yǎng)，正常培養(yǎng)1周后，進行干預。對照組為單純培養(yǎng)液，LPS組加入不同濃度的LPS(1、10、30、60 μg/ml)，應用SMI-32和calretinin免疫組化染色對培養(yǎng)后2、3、4周時的脊髓薄片腹角運動神經(jīng)元和背角中間神經(jīng)元進行計數(shù)，透射電鏡觀察超微結構變化，測定各時點培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量，利用RT-PCR技術觀察LPS處理后腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、

6、白介素-1β(L-1β)mRNA表達水平。選取30 μg/ml LPS處理2周作為進行藥物干預實驗的劑量和時間。脊髓片體外培養(yǎng)1周后，分別給予單純培養(yǎng)液、LPS(30 μg/ml)、細胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM(10 μmol/L)加LPS(30μg/ml)，干預2周后用免疫組化方法顯示運動神經(jīng)元，計數(shù)各組運動神經(jīng)元數(shù)量。 結果：(1)正常對照組脊髓薄片在體外存活良好，運動神經(jīng)元數(shù)目恒定，1μg/ml LPS組各時點運動神

7、經(jīng)元數(shù)量無顯著變化(P>0.05)，10μg/mlLPS組運動神經(jīng)元數(shù)量隨時間延長而逐漸減少，處理3周后與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，而30、60μg/ml LPS組分別在處理2周和1周后出現(xiàn)運動神經(jīng)元數(shù)量的減少(P<0.05，P<0.01)。(2)1、10、30 μg/ml LPS處理1～3周以及60 μg/ml LPS處理2周內(nèi)背角中間神經(jīng)元數(shù)量與對照組相比無顯著變化(P>0.05)，60 μg/ml LPS處理3周后中

8、間神經(jīng)元數(shù)量開始減少(P<0.05)。(3)10μg/ml LPS處理3周后出現(xiàn)LDH含量增高(P<0.05)，而30、60 μg/ml LPS組LDH在LPS處理2周后即開始增高，與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。(4)透射電鏡觀察，對照組神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞結構基本正常；30 μg/ml LPS處理2周后，超微結構顯示腹角運動神經(jīng)元空泡變性，線粒體腫脹、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體擴張，脊髓背角中間神經(jīng)元超微結構改變不明顯，小膠質(zhì)細

9、胞體積明顯增大，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量的脂滴和膜性小體。(5)30、60 μg/ml LPS處理1天后，TNF-α mRNA水平較對照組明顯增高(P<0.05，P<0.01)；處理3天后，IL-1β表達水平也明顯升高(P<0.01)。(6)脊髓薄片體外培養(yǎng)1周后，同時應用10 μmol/L BAPTA-AM和30 μg/ml LPS進行干預，與LPS組相比，運動神經(jīng)元存活數(shù)量明顯增加(P<0.01)，胞體形態(tài)規(guī)則，突起增多。 結論：在體

10、外脊髓器官型培養(yǎng)體系中加入LPS，可以誘導炎癥反應，引起劑量和時間依賴性的運動神經(jīng)元數(shù)量減少和培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶含量增高。30μg/ml LPS作用2周后，可引起SMI-32陽性運動神經(jīng)元減少，超微結構改變，而并不明顯影響中間神經(jīng)元的存活，與ALS的病理特點相一致，可用于制備ALS的脊髓器官型培養(yǎng)模型。運動神經(jīng)元缺乏鈣網(wǎng)膜蛋白表達，而細胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM減輕運動神經(jīng)元損傷，提示鈣離子緩沖能力較低是其較易受損的原因之一。該模

11、型的建立，為后續(xù)研究ALS的發(fā)病機制、探索新的治療策略提供了實驗基礎。 二、NADPH氧化酶參與脂多糖誘導的運動神經(jīng)元損傷 目的：利用LPS誘導的運動神經(jīng)元相對選擇性受損的脊髓器官型培養(yǎng)模型，研究NADPH氧化酶在其中的變化規(guī)律，并應用相應的抑制劑反證其作用，以期闡明炎癥過程中運動神經(jīng)元受損的關鍵機制，從而為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。 方法：選用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓組織切片進行體外培養(yǎng)，正常培養(yǎng)1周后，

12、分別給予單純培養(yǎng)液、LPS(30μg/ml)、NADPH氧化酶抑制劑apocynin(0.5、1mmol/L)加LPS(30μg/ml)，干預2周后，用SMI-32免疫組化染色對運動神經(jīng)元進行鑒定、計數(shù)。利用RT-PCR、Western blot等方法，檢測NADPH氧化酶亞基gp91phox和p47phox mRNA水平、蛋白含量的變化，并測定各組脊髓薄片組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量和培養(yǎng)液中LDH含量。 結論：器

13、官型脊髓培養(yǎng)組織經(jīng)LPS處理后，胞膜中p47phox含量明顯增加，NADPH氧化酶活性增高。給予apocynin干預，可以抑制p47phox亞基從胞漿轉位到胞膜，從而抑制NADPH王氧化酶激活，進而產(chǎn)生保護運動神經(jīng)元的作用，培養(yǎng)液中LDH含量和脊髓薄片組織中MDA含量也較LPS組明顯下降，從不同角度證實了apocynin的有益作用。本研究證實了NADPH氧化酶在LPS誘導的炎癥反應介導的運動神經(jīng)元損傷中發(fā)揮著關鍵作用，為ALS的治療提供

14、新策略。 三、一氧化氮在脂多糖誘導的脊髓前角運動神經(jīng)元損傷中的作用 目的：在脊髓器官型培養(yǎng)模型的基礎上，觀察LPS干預后iNOS和nNOS的表達情況、酶活力變化以及NO水平的改變，并應用NOS相應的選擇性或非選擇性抑制劑，探討NO在炎癥介導的運動神經(jīng)元損傷中的確切作用。 方法：選用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓組織切片進行體外培養(yǎng)，正常培養(yǎng)1周后，分別給予單純培養(yǎng)液、LPS(30或60μg/ml)，處理3天或2周后，

15、收集脊髓薄片組織，檢測各組NOS mRNA水平和酶活性改變；并留取處理3天、1周、2周后培養(yǎng)液，測定NO含量變化。藥物干預實驗時LPS濃度選用30μg/ml，分為以下幾組：對照組、LPS組、iNOS選擇性抑制劑1400W或AG加LPS組、nNOS選擇性抑制劑7-NI加LPS組、NOS非選擇性抑制劑L-NAME加LPS組，測定干預后3天、1周、2周后培養(yǎng)液中NO含量，并應用SMI-32免疫組化染色對運動神經(jīng)元進行鑒定、計數(shù)。 結論

16、：LPS在脊髓器官型培養(yǎng)體系中可以誘導iNOS mRNA水平和酶活力升高、nNOS活性增加以及NO生成增多，但應用iNOS抑制劑1400W和AG、nNOS抑制劑7-NI、NOS非選擇性抑制劑L-NAME均未證實NO在該培養(yǎng)體系中對介導運動神經(jīng)元損傷具有關鍵作用，單純抑制NO生成并不能明顯改善運動神經(jīng)元的存活。鑒于NO來源于三種不同的NOS及其自身作用的雙重性，在疾病的不同階段調(diào)控不同來源NO的生成量比單純抑制NO生成將可能具有更好的治療