中藥“脊髓康”對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的保護作用及機制研究.pdf

1、背景:脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是脊柱疾病和脊柱損傷的嚴(yán)重并發(fā)癥，中醫(yī)藥所具備的多因素、多靶點作用的優(yōu)點，正逐步成為促進SCI后神經(jīng)再生的研究熱點。中藥復(fù)方“脊髓康”是基于SCI“腎督虛損，瘀阻督脈，樞機統(tǒng)率失職”病機特點，在“溫腎通督”理論指導(dǎo)下組方而成的臨床驗方，大量前期研究已證實其促進SCI修復(fù)作用確切，然而其具體干預(yù)機制尚不明確。
　　目的:體外構(gòu)建大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡模型，觀察“脊髓康”含藥血

2、清對損傷神經(jīng)元的存活及凋亡的影響，探討“脊髓康”抗脊髓損傷的可能作用機制。
　　方法:體外分離培養(yǎng)鑒定大鼠脊髓神經(jīng)元;制備谷氨酸誘導(dǎo)凋亡模型;以不同劑量中藥復(fù)方“脊髓康”及強的松含藥血清配制的完全培養(yǎng)基干預(yù)神經(jīng)元損傷模型，通過形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8法、TUNEL法觀察神經(jīng)元的存活與凋亡，Western blot、qRT-PCR等分子生物學(xué)方法檢測凋亡指標(biāo)bcl-2、bax及Caspase3的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)神經(jīng)元存活

3、情況:體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元誘導(dǎo)凋亡后，大部分突觸斷裂回縮，部分胞核固縮、胞質(zhì)出現(xiàn)空泡、胞體崩解;加入強的松及不同濃度的脊髓康含藥血清培48h后，神經(jīng)元壞死的速率呈現(xiàn)不同程度地減慢。其中強的松組細(xì)胞存活最多，輪廓清晰完整，再生突觸交織成網(wǎng)，實驗1組細(xì)胞壞死崩解較多，存活細(xì)胞輪廓模糊、再生突觸稀疏，實驗2、3組細(xì)胞存活較多，以實驗3組細(xì)胞輪廓更清晰，折光強，存活細(xì)胞明顯聚集生長。CCK-8結(jié)果顯示，各組間細(xì)胞存活不全相同（P＜0.01），除

4、實驗2組外，其余各組均高于模型組(P＜0.01)，三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　(2)神經(jīng)元的凋亡情況:神經(jīng)元損傷后加入含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)48h，模型組可見大量凋亡神經(jīng)元，僅少量存活，形態(tài)不規(guī)則;強的松組存活神經(jīng)元較多，少量細(xì)胞凋亡;脊髓康低劑量組大量神經(jīng)元呈核質(zhì)深染，胞體輪廓不清;中劑量組較多神經(jīng)元凋亡，存活神經(jīng)元排列紊亂，輪廓尚可見;高劑量組可見部分凋亡細(xì)胞，存活細(xì)胞突觸明顯，部分交織成網(wǎng)狀。高劑量組凋亡率低

5、于陽性對照組和中劑量組，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);低劑量組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(3) Western blot結(jié)果顯示:各組神經(jīng)元bcl-2、bax、Caspase3蛋白相對表達(dá)水平不全相同，表達(dá)高低依次為:bcl-2:高劑量組＞強的松組＞中劑量組＞低劑量組＞模型組（P＜0.01）;bax:模型組＞低劑量組＞中劑量組＞高劑量組＞強的松組(P＜0.01)。bcl-2/bax比值:強的松組＞

6、高劑量組＞中劑量組＞低劑量組＞模型組(P＜0.01)。Caspase3:模型組＞低劑量組＞中劑量組＞強的松組＞高劑量組（P＜0.001）。
　　(4)熒光定量PCR結(jié)果與蛋白表達(dá)結(jié)果基本一致，各組mRNA表達(dá)高低依次為:bcl-2:強的松組＞高劑量組＞中劑量組＞低劑量組(P＜0.01);bax:低劑量組＞中劑量組＞高劑量組＞強的松組(P＜0.01)。bcl-2/bax:強的松組明顯上調(diào)這一比例，脊髓康低、高劑量組高于中劑量組，但脊

7、髓康低劑量組與高劑量組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.825＞0.05)。Caspase3:強的松組和脊髓康高劑量組明顯低于脊髓康低、中劑量組(P＜0.01)，而強的松組與脊髓康高劑量組間、脊髓康低、中劑量組間比較均無統(tǒng)計學(xué)(P＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)100μM的Glu在一定程度上模擬了SCI后體內(nèi)神經(jīng)元生存的微壞境，能夠引起體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元的凋亡，可用于制備SCI的細(xì)胞模型。
　　(2)強的松及脊髓康中、高劑量血清

8、均有利于損傷后神經(jīng)元存活，存活細(xì)胞數(shù)量三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，降低凋亡率方面脊髓康高劑量組優(yōu)于其他干預(yù)組。
　　(3)強的松以及脊髓康3個劑量均能夠提高神經(jīng)元bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)、抑制bax、Caspase3蛋白及mRNA的表達(dá)，并上調(diào)bcl-2/bax的比值;脊髓康3個劑量中高劑量作用更明顯，在上調(diào)bcl-2蛋白、抑制Caspase3蛋白表達(dá)略優(yōu)于強的松組，其余指標(biāo)均劣于強的松組但優(yōu)于低中劑量組。結(jié)合神經(jīng)元的存活率