水牛精液蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究.pdf

1、精液與雄性生殖疾病密切相關(guān)，近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)為精液研究提供了新的有效的研究方法。迄今為止，蛋白質(zhì)組學(xué)已運(yùn)用在人、鼠等多種動(dòng)物的精液研究中，促進(jìn)了精子發(fā)生分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)和雄性生殖疾病治療。本研究主要在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)水牛精液進(jìn)行更為深入的研究，進(jìn)一步優(yōu)化水牛精液蛋白質(zhì)組學(xué)體系，為后續(xù)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)提供良好的技術(shù)支撐。此外，分離鑒定高、低活力水牛精子之間以及高畸形率、正常精子之間的表達(dá)差異蛋白，為理解活力低下、形態(tài)異常的

2、機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 第一章：通過比較IPG膠條的長(zhǎng)度、線性或非線性、上樣量、SDS-PAGE膠濃度、純化蛋白的方法等參數(shù)，優(yōu)化水牛精子蛋白雙向電泳蛋白質(zhì)組學(xué)體系。試驗(yàn)結(jié)果顯示，用丙酮沉淀法純化蛋白，上樣量350μg，并使用24 cmpH3-10 NL IPG膠條，濃度12.5％的SDS-PAGE膠進(jìn)行雙向電泳，能獲得了分辨率高、質(zhì)量更好的含有約500多個(gè)蛋白點(diǎn)的水牛精子蛋白2-DE圖譜。
　　 第二章：運(yùn)用已優(yōu)化的

3、雙向電泳技術(shù)體系分離高、低活力水牛精子蛋白，使用ImageMaster2.0軟件比較分析兩者2-DE圖譜，并結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸附電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和生物信息學(xué)鑒定差異蛋白點(diǎn)。本章試驗(yàn)建立了高、低活力的水牛精子差異蛋白表達(dá)的2-DE圖譜，并篩選得到18個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中有5個(gè)蛋白點(diǎn)在低活力的水牛精子中表達(dá)下調(diào)，8個(gè)表達(dá)上調(diào)，1個(gè)缺失，4個(gè)在高活力水牛精子中缺失。最終，質(zhì)譜成功鑒定了其中4個(gè)，分別對(duì)應(yīng)3種蛋白：

4、精子尾部結(jié)構(gòu)蛋白2、α-ATP合成酶、α-琥珀酰輔酶A合成酶。精子尾部結(jié)構(gòu)蛋白2、α-ATP合成酶在低活力精子中表達(dá)下調(diào)，α-琥珀酰輔酶A合成酶表達(dá)上調(diào)，這些差異點(diǎn)可能與精子活力相關(guān)。
　　 第三章與第二章的試驗(yàn)方法一致。本章試驗(yàn)建立了高畸形率、正常水牛精子蛋白雙向電泳差異蛋白表達(dá)譜，并篩選得到16個(gè)表達(dá)差異明顯的蛋白點(diǎn)，其中5個(gè)蛋白點(diǎn)在畸形率高的水牛精子中表達(dá)量上調(diào)，6個(gè)表達(dá)量下調(diào)，3個(gè)缺失，2個(gè)在正常水牛精子中缺失。并運(yùn)用質(zhì)

5、譜成功鑒定了6個(gè)，分別對(duì)應(yīng)4種蛋白：左旋天冬酰胺酶、熱應(yīng)激蛋白、半乳糖激酶、β-微管蛋白。左旋天冬酰胺酶、熱應(yīng)激蛋白、半乳糖激酶在畸形率高的水牛精子上表達(dá)量上調(diào)，β-微管蛋白表達(dá)量則下降。這些差異點(diǎn)與精子結(jié)構(gòu)、代謝等有關(guān)，可能與精子形態(tài)結(jié)構(gòu)異常相關(guān)聯(lián)。
　　 第四章試驗(yàn)主要通過對(duì)比不同上樣量，進(jìn)一步優(yōu)化水牛精漿雙向電泳體系，并使用質(zhì)譜技術(shù)鑒定部分水牛精漿蛋白。結(jié)果表明，300μg的上樣量?jī)?yōu)于200μg和300μg，使用300μg

6、上樣量于非線性的24 cm pH3-10的IPG膠條，獲得了蛋白點(diǎn)500多個(gè)的水牛精漿2-DE圖譜。質(zhì)譜鑒定103個(gè)豐度相對(duì)較高的水牛精漿蛋白點(diǎn)，最終27個(gè)被成功鑒定，分別對(duì)應(yīng)15種蛋白：血清白蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、T-復(fù)合蛋白1-β、磷酸甘油酸激酶、山梨醇脫氫酶、果糖-1，6-二磷酸酶、肌動(dòng)蛋白、鋅α2糖蛋白、過敏原Bosd2、牛精清蛋白-30kDa、過氧化還原酶-5、附睪分泌蛋白E1、溶菌酶c-3、核糖核酸酶、磷酸變位酶。