HPLC法測(cè)定兔角膜基質(zhì)中核黃素含量的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:兔角膜基質(zhì)中核黃素含量測(cè)定的HPLC方法建立
　　目的:建立兔角膜基質(zhì)中核黃素含量測(cè)定的高效液相色譜(high performance liquid chromatograph,HPLC)分析方法,并分析該方法的專屬性、靈敏度和準(zhǔn)確性。
　　方法:兔角膜組織勻漿經(jīng)加熱孵育和10％三氯乙酸去蛋白后離心,組織上清液經(jīng)C18-SPE柱固相萃取后檢測(cè)。高效液相色譜條件:色譜柱柱選擇Sina ChromODS-BP色譜柱(5

2、μm,250mm×4.6mmID);以甲醇-純水(體積比為40:60)為流動(dòng)相,pH=7.0;流速:0.1mL/min;熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)425nm,發(fā)射波長(zhǎng)525nm。
　　結(jié)果:核黃素在1.0×10-6～1.0×10-4mg/mL范圍與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r2=0.999584),最低檢測(cè)限達(dá)到2×10-8mg/mL,精密度結(jié)果顯示:相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation,RSD)=0.86%(

3、n=10);方法穩(wěn)定性檢測(cè)得到樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性RSD=0.51%;測(cè)得的角膜樣品核黃素加標(biāo)平均回收率為99.3%,RSD為3.7%。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究中建立的樣品前處理方法簡(jiǎn)單,且HPLC方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好,可作為紫外線A/核黃素角膜膠原交聯(lián)法中角膜基質(zhì)內(nèi)核黃素含量測(cè)定的定量方法。
　　第二部分:三種條件下兔角膜基質(zhì)中核黃素含量測(cè)定
　　目的:用高效液相色譜(HPLC)分析法檢測(cè)不同條件下角膜

4、基質(zhì)中核黃素的含量,分析比較去上皮、不去上皮以及使用促滲劑乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)對(duì)核黃素在角膜基質(zhì)滲透的影響,初步探討EDTA在跨角膜上皮膠原交聯(lián)中的可行性依據(jù)。
　　方法:新西蘭白兔15只,隨機(jī)分為去上皮組、EDTA組和不去上皮組3組,每組5只,處理:去上皮組去除角膜完整上皮,EDTA組不去上皮點(diǎn)0.5%EDTA1h,不去上皮組不做處理,之后各組兔眼分別滴0.1%核

5、黃素+20%右旋糖酐30分鐘,隨后去除EDTA、不去上皮組角膜完整上皮,鉆取各分組兔眼直徑8.5mm角膜中央組織,制取角膜組織勻漿上清液,在建立好的高效液相色譜分析法條件下對(duì)各組組織勻漿上清液進(jìn)行核黃素定量檢測(cè)。
　　結(jié)果:0.1%核黃素+20%右旋糖酐點(diǎn)眼30分鐘后去上皮組角膜基質(zhì)中核黃素含量為23.54±1.61μg/g組織,EDTA組為2.04±0.25μg/g組織,不去上皮組為1.44±0.06μg/g組織。去上皮組、ED

6、TA組、不去上皮組角膜樣品中核黃素含量的總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1792.839,P=0.000)。去上皮組和EDTA組角膜樣品中核黃素含量較不去上皮組明顯增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=43.408、t=7.484,p<0.05),去上皮組與EDTA組比較,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=41.780,p<0.05)。除去上皮組角膜基質(zhì)內(nèi)核黃素含量超過(guò)15μg/g組織以外,其余兩組均未達(dá)到此理論值。
　　結(jié)論:交聯(lián)術(shù)前的去角膜上皮能充分